[发明专利]一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备

说明书

本发明公开了一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，采用BCA蛋白浓度方法构建标准蛋白浓度的标准曲线，通过标准曲线计算待测toxA‑N纯化蛋白的浓度，制备抗原，再进行多杀性巴氏杆菌毒素toxA‑N蛋白多克隆抗体和单克隆抗体的制备。通过生物技术方法将纯化后的toxA‑N蛋白制备成抗原，通过对大白兔的皮下注射及昆明鼠的腹腔注射，刺激机体发生免疫应答，产生对应宿主的抗体。将制备多克隆抗体进行倍比稀释，在1:6400时P/N仍然>2，而单克隆抗体因其特异性高，稀释至1:64000时P/N依旧>2.5，完全符合制备抗体的要求。

技术领域

本发明属于毒素基因抗体制备领域，具体涉及一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备。

背景技术

研究发现，多杀性巴氏杆菌众多的致病因子中以多杀性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)毒性最高，且在致病过程中扮演主要作用。目前，国内关于羊感染多杀性巴氏杆菌的研究很少，相应的疫苗研究也很缺乏，临产上主要以抗生素进行预防。因此，羊巴氏杆菌病疫苗的研究迫在眉睫。

多杀性巴氏杆菌病是一种常见的人畜共患性疾病，其血清型多样，致病性复杂。通过血清型分型方法对多杀性巴氏杆菌进行分型，由荚膜抗原(K抗原)可分为A、B、D、E、F五种血清型，由脂多糖抗原(O抗原)分为16种血清型(1-16)，根据是否产多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)，分为非产毒多杀性巴氏杆菌(T^-Pm)和产毒多杀性巴氏杆菌(T⁺Pm)。临床上，因抗原性和宿主特异性的差异，造成了多种临床症状，例如猪的萎缩性鼻炎，牛羊的出血性败血症，禽类的禽霍乱等。随着广谱抗生素的滥用，多杀性巴氏杆菌的致病率及家畜死亡率日益增高，严重危害我国养殖户的经济效益。

多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)是一种大分子蛋白，相对分子质量为146ku，具有不耐热、不耐酸等特性。PMT蛋白是一种典型的AB结构蛋白，由C端和N端两个结构域构成，中间为跨膜部位。C端与生物活性效应有关，为催化作用位点，N端与靶细胞的结合以及生物胞吞作用有关，为黏附作用位点。研究发现，PMT蛋白N端是多杀性巴氏杆菌毒素与受体结合并发挥重要作用的桥梁，然而，天然和人工合成的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白分泌量很低，不到菌体的0.5％，但通过PMT蛋白的亚克隆，却能大量获得融合蛋白。经生物信息学软件对PMT蛋白及toxA-N蛋白进行分析，发现PMT蛋白N端与亚克隆表达的toxA-N蛋白的具有一些相同特性，例如空间结构、抗原表位、氨基酸构成等。因此，通过对toxA-N蛋白的生物学研究来揭示多杀性巴氏杆菌毒素的致病机理以及信息传递通路。

发明内容

本发明的目的是提供一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，通过将toxA-N蛋白制备成抗原，制备出特异性高的多克隆抗体和单克隆抗体。

本发明所采用的技术方案是：一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，具体按照以下步骤实施：

步骤1，多杀性巴氏杆菌toxA-N蛋白抗原的制备：

步骤1.1：待测toxA-N纯化蛋白浓度的测定

采用BCA蛋白浓度测量方法，构建标准蛋白溶液浓度的标准曲线，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌toxA-N蛋白，通过标准曲线法计算待测toxA-N纯化蛋白的浓度；

步骤1.2：抗原的制备

用灭菌后的生理盐水稀释步骤1.1中已知浓度的toxA-N蛋白，并使其终浓度为1ug/μL，将稀释后的toxA-N蛋白按1：1的比例与相应的弗氏佐剂进行乳化，用注射器快速吹打混合，直至乳化液滴到静止的水面上不扩散为止，即乳化完全，抗原制备成功；

步骤2，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白多克隆抗体的制备：