[发明专利]华法林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及华法林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。所述华法林半抗原的结构如式(I)所示：所述华法林人工抗原是由式(I)所示半抗原与载体蛋白偶联得到。利用所述华法林人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的华法林半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的华法林检测方法提供了新手段。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及华法林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

华法林(warfarin，WAR)是一种香豆素类抗凝血剂，是应用最早、最畅销且使用最广泛的灭鼠药。因其结构与维生素K相似，可以抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝脏的合成。当鼠食用大量药物后会出现内脏出血至死的现象，从而达到高效灭鼠的效果。而人体摄入过量华法林后会发生皮肤淤血和胃出血、肠道出血等内出血的现象，后果较为严重。由于华法林便宜易获得，应用广泛，经常会发生一些误食，恶意投毒，二次中毒等中毒事件，严重影响威胁了公共卫生安全。因此，在发生中毒事件后有必要对生物样本中华法林的进行检测，为病因的确证和临床治疗奠定基础。

目前，生物样品中华法林的检测方法主要有高效液相色谱法，液质联用等仪器分析方法。尽管仪器分析方法是确证方法，但存在检测成本高，需要专门人员进行操作，样品处理复杂等缺点，无法满足大批量样本快速筛查。免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，已成为大量样本的现场快速检测的通用方法。免疫分析方法的关键在于抗原的设计和抗体的制备。利用化学合成法，合成有一定的复杂性或刚性，结构基本满足抗体制备的前提下具有活性基团的半抗原。根据半抗原的活性基团，选择相应的生物偶联方法，将半抗原与载体蛋白偶联，制备完全抗原，免疫模式动物，获得抗体，为免疫分析方法的建立奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供华法林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供华法林半抗原，其结构如式(I)所示：

第二方面，本发明提供所述半抗原的制备方法，包括如下步骤：

1)4-羟基香豆素、苯亚甲基丙酮与DL-脯氨酸反应得到化合物3；

2)化合物3与苄溴反应得到化合物4；

3)化合物4与2-(二乙氧膦酰)乙酸叔丁酯反应得到化合物6；

4)化合物6发生氢化反应得到化合物7；

5)化合物7与三氟乙酸反应得到华法林半抗原；

其中，所述化合物3、4、6、7的结构分别如下：

进一步地，前述制备方法包括如下步骤：

1)化合物3的合成：将1.62g 4-羟基香豆素、1.46mg苯亚甲基丙酮与含580mg DL-脯氨酸的DMSO溶液20mL混合，于20℃搅拌16h；向反应混合物中加水120mL；反应混合物用乙酸乙酯(100mL)提取(优选提取3次)；合并有机相，依次用水(100mL)、饱和食盐水(100mL)洗，然后用硫酸镁干燥，溶剂旋干后所得残留物用硅胶柱层析(优选流动相为石油醚和乙酸乙酯体积比4:1的混合物)分离，得到化合物3；

2)化合物4的合成：将616mg化合物3、376mg苄溴与含607mg碳酸钾的丙酮溶液20mL混合，25℃回流24h；溶剂旋干后，向所得残留物中加入1N盐酸溶液30mL，然后用乙酸乙酯(50mL)提取(优选提取2次)；合并有机相，用硫酸镁干燥，溶剂旋干后所得残留物用硅胶柱层析(优选流动相为石油醚和乙酸乙酯体积比4:1的混合物)分离，得到化合物4；