[发明专利]CTLA-4类似物CFN13及CFN13-Fc基因和蛋白

说明书

本发明公开了一种CTLA‑4类似物CFN13及CFN13‑Fc基因和蛋白，基于FN3的结构，将结合CD80的受体CTLA‑4关键区域1的8个氨基酸序列替换FN3的BC环的8个氨基酸，CTLA‑4关键区域2的10个氨基酸序列替换FN3的FG环的10个氨基酸而得到的抗体类似物CFN13蛋白。该蛋白性质具有稳定，分子量小等特点。进一步，将CFN13与人IgG1Fc融合，构建CFN13‑Fc基因及融合蛋白，通过生物实验验证了CFN13蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基础。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种CTLA-4类似物CFN13基因和蛋白及其与人IgG1Fc融合基因及融合蛋白。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)是共刺激分子CD28家族成员，作为抑制性受体，它与CD28竞争结合共享配体B7分子,抑制CD28的功能(1)。在免疫反应过程中，T细胞通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别病原微生物、肿瘤等抗原,在共刺激分子CD28提供的第二信号共同作用下而活化，产生免疫效应，清除病原微生物和肿瘤细胞，发挥细胞免疫的抗感染、抗肿瘤功能。然而，除协同刺激信号外，T细胞的作用还受到抑制信号的负向调节，以防止过度免疫反应造成的组织损伤。这些负抑制信号也被称为免疫检查点(2)。CTLA-4作为重要的免疫检测点分子，抑制CD28分子的正向调节作用，从而下调T细胞应答。因此，免疫检查点抑制剂就是通过阻断这些免疫抑制信号的传递，提高T细胞的抗肿瘤免疫反应。目前,肿瘤免疫检查点抑制剂是肿瘤免疫治疗(Immuno-oncology,I/O)药物治疗的最主要方面，通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能消除肿瘤(3)。2011年，FDA批准了CTLA-4抗体Yervoy(ipilimumab，易普利姆玛)用于治疗转移的黑色素瘤患者，标志着癌症免疫治疗革命的开端，为众多癌症患者带来了新的希望(4)。

抗体分子是B淋巴细胞产生的一类大分子蛋白，它由两条重链和两条轻链组成，由于抗体具有高度的亲和性和特异性等特点。利用抗体分子作为药物治疗疾病已经在临床上广泛应用，其销售额每年都快速递增。2000-2010年，抗体药物在全球生物制药中的市场份额从10.5％上升到56.4％，成为生物制药行业中占比最大的子行业，被认为是未来生物医药领域发展的主旋律。全球抗体类药物销售额从2011年的不到500亿美元增加到2017年的1060亿美元。因此，抗体是重要的生物药物。尽管抗体分子有着较强的结合能力和选择性，但是由于抗体本身的一些性质，如相对分子质量大(约为1.5x10⁵)、结构复杂、依赖二硫键的连结等，也导致了抗体分子的热稳定性差、制备过程复杂、进入实体瘤效率低等问题。因此，抗体的临床应用仍然具有较大的局限性。抗体类似物是新一代的生物药物，它具有与抗体类似的高亲和力和特异性强等特点，又有着一些抗体所没有的优点：相对分子质量小、折叠速率快、结构稳定、选择性和亲和力高.以及可以经受化学修饰等。目前，以纤粘蛋白Ⅲ型结构域(Fibronectin 3，FN3)为骨架的抗体类似物的研究较多(5，6)。FN3是由94个氨基酸所组成的-折叠片层分子，具有结构稳定，在大肠杆菌中高效、可溶性表达等特点。FN3的BC、DE和FG三个环(loop)类似于抗体分子中结合抗原的互补决定区(complementarydetermine region，CDR)(见图1)，可以被替换或突变,展示配体结合肽，从而形成新的配体结合分子，又称为Adnectin或monobody。其中一些Adnectin分子已进入临床试验如拮抗血管生长因子(VEGF)的Adnectin分子，CT-322(7)。因此，基于FN3骨架蛋白设计的新型抗体类药物有望成为新一代生物药物。

我们在分析CTLA-4结合配体的模式后，截取结合的关键区域和氨基酸，嫁接到FN3的BC和FG环，构建了CFN13。

参考文献：