[发明专利]氯灭鼠灵半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及氯灭鼠灵半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。所述氯灭鼠灵半抗原的结构如式(I)所示：所述氯灭鼠灵人工抗原是由式(I)所示半抗原与载体蛋白偶联得到。利用所述氯灭鼠灵人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的氯灭鼠灵半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的氯灭鼠灵检测方法提供了新手段。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及氯灭鼠灵半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

氯灭鼠灵(coumachlor，COU)是一种第二代香豆素类抗凝血剂，其毒性大，灭鼠效果较好，是一种应用颇为广泛的杀鼠剂。因其结构与维生素K相似，可以抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ在肝脏的合成。当鼠食用大量药物后会出现内脏出血至死的现象，从而达到高效灭鼠的效果。而人体摄入过量氯灭鼠灵后会发生皮肤淤血和胃出血、肠道出血等内出血的现象，后果较为严重。由于氯灭鼠灵灭鼠效果较好，应用广泛，经常会发生一些误食，恶意投毒，二次中毒等中毒事件，严重影响威胁了公共卫生安全。因此，在发生中毒事件后有必要对生物样本中氯灭鼠灵进行检测，为病因的确证和临床治疗奠定基础。

目前，生物样品中氯灭鼠灵的检测方法主要有高效液相色谱法，液质联用等仪器分析方法。尽管仪器分析方法是确证方法，但存在检测成本高，需要专门人员进行操作，样品处理复杂等缺点，无法满足大批量样本快速筛查。免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，已成为大量样本的现场快速检测的通用方法。免疫分析方法的关键在于抗原的设计和抗体的制备。利用化学合成法，合成有一定的复杂性或刚性，结构基本满足抗体制备的前提下具有活性基团的半抗原。根据半抗原的活性基团，选择相应的生物偶联方法，将半抗原与载体蛋白偶联，制备完全抗原，免疫模式动物，获得抗体，为免疫分析方法的建立奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供氯灭鼠灵半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供氯灭鼠灵半抗原(COU-CMO)，其结构如式(I)所示：

第二方面，本发明提供所述半抗原的制备方法，氯灭鼠灵与羧甲基羟氨盐酸盐反应得到所述氯灭鼠灵半抗原。

进一步地，所述半抗原的制备方法具体如下：将氯灭鼠灵80mg和羧甲基羟氨盐酸盐(CMO)30mg，溶于5mL吡啶溶液中，然后转移到带有冷凝装置的圆底烧瓶中，70℃磁力搅拌反应6h，反应液在水浴氮气仪下吹干(70℃)；向残渣中加入0.1M的NaHCO₃溶液3mL，涡旋使残渣溶解，然后用乙酸乙酯萃取3次，收集水相，用稀盐酸(0.1M HCl)调pH＝3，用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，在水浴氮气仪下吹干(30℃)，即得所述氯灭鼠灵半抗原。

本发明氯灭鼠灵半抗原合成路线见图1。

第三方面，本发明提供氯灭鼠灵人工抗原，是由所述氯灭鼠灵半抗原与载体蛋白偶联后得到。所述氯灭鼠灵人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。

其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白、卵清蛋白。

第四方面，本发明提供所述人工抗原的制备方法，采用活化酯法(Active estermethod，NHS)将载体蛋白偶联于所述氯灭鼠灵半抗原的羧基碳上。

可选地，式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联摩尔比为16:1。

第五方面，本发明提供由所述氯灭鼠灵人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。所述多克隆抗体可通过氯灭鼠灵人工抗原免疫实验动物(如小鼠)，收集血清纯化获得。

第六方面，本发明提供所述氯灭鼠灵半抗原或所述氯灭鼠灵人工抗原的以下任一应用：