[发明专利]一株产葡萄糖氧化酶的海洋细菌及其应用

权利要求书

1.一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobacter sp.)8-Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC NO.17228。

2.根据权利要求1所述的一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌，其特征在于，筛选方法包括以下步骤：

步骤1、在无菌操作条件下取大连地区渤海海域的海泥样品，加入装有无菌富集培养基和玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀，放入摇床培养箱中20-25℃，160-200r/min培养12-24h，得到样品菌液；

步骤2、将富集后的各样品菌液，用无菌海水稀释到不同梯度，每个梯度取100μL涂布于固体筛选培养基平板上，其置于20-25℃下，倒置培养48-72h，设置平行实验；选取周边培养基出现蓝色显色反应的菌落，继续进行平板划线纯化；

步骤3、挑取经过步骤1和2初筛得到的纯化菌株接种于发酵培养基，20-25℃，160-200r/min培养48-72h；然后将菌液于8000r/min离心15min，取上清加入酶活反应体系，在460nm处测量其OD值；每间隔一分钟观察一次，OD值呈现连续上升代表该菌株所产的酶存在酶活；

步骤4、将步骤3中离心后的菌在LB固体培养基上观察复筛得到菌落的颜色、形状、光泽、透明程度等形态上的特点；利用电镜观察微生物的形态；20-25℃培养48-72h后进行16sRNA鉴定，如SEQ ID NO.1所示，GenBanK号为MK050005，确定菌株属于为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的富集培养基配方为：酵母提取物0.5-1％，蛋白胨1-3％，氯化钠1-2％。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的固体筛选培养基配方为：葡萄糖4.5-6％，蛋白胨0.27-0.45％，KH₂PO₄ 0.02-0.04％，(NH₄)₂HPO₄ 0.035-0.05％，CaCO₃0.3-0.5％，可溶性淀粉0.5-1％，MgSO₄ 0.015-0.02％，脱氧胆酸钠0.02-0.03％，氯霉素0.01-0.03％，多氧霉素0.01-0.03％，辣根过氧化物酶0.02-0.04％，邻联茴香胺0.1-0.2％，琼脂粉2-2.5％。

5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖4-6％，蛋白胨0.3-0.5％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，硫酸镁0.05-1％，氯化钾0.05-1％，硝酸钠4-6％，pH7.0。

6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的LB固体培养基配方为：酵母提取物0.5-1％，蛋白胨0.5-1％，氯化钠0.5-1％，琼脂2-2.5％。

7.产葡萄糖氧化酶的海洋细菌(Citrobacter sp.)8-Ⅲ菌株在制备葡萄糖氧化酶中应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下：

步骤1、将8-Ⅲ菌株以2-3％比例接种于LB液体培养基，20-25℃，160-200rpm培养48-72h；LB液体培养基：0.5-1％氯化钠、0.5-1％酵母提取物、0.5-1％蛋白胨；

步骤2、取步骤1培养好的菌液200μL接种于100mL发酵培养基，20-25℃，160-200rpm培养48-72h；

步骤3、将步骤2所得菌液与饱和硫酸铵溶液混合使硫酸铵饱和度达到75％，0-4℃静置12-16h；

步骤4、将步骤3所得菌液8000rpm离心15min，弃上清，以10mLpH7.4的PBS重悬沉淀；

步骤5、将重悬液超声裂解15min，开3S，间隔5S，功率200W；将裂解液10000r/min，4℃，离心20min，上清液为粗酶液；

步骤6、粗蛋白经G-100和Ni²⁺-NTA柱进行亲和层析纯化得到纯化后的葡萄糖氧化酶，洗脱的蛋白液4℃保存；

步骤7、将步骤6中得到的纯化后的酶液置于冻干机中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶酶粉。