[发明专利]一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法

权利要求书

1.一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法，其特征在于：所述方法包括如下：

1）选取表现蚕豆萎蔫病毒症状的太子参植株；

2）取病株植株切取茎段，经灭菌消 毒后接种到含0.2mg/L NAA的MS培养基中，待长到4个节时，取茎段接种到MS培养基中，侧芽长1-1.5cm时取1-2mm的芽尖接种到MS培养基中，微茎尖培养至成苗；

3）切取茎尖培养的茎段，接到初代培养基上，室温下培养10d；

4）取步骤3）太子参茎段放在继代培养基上室温培养1-6周；

5）剥取步骤4）获得的茎尖1-2mm，叶原基留1-3片，茎尖放在培养基上暗培养1-3天，培养基为MS培养基加0.3mol/L蔗糖、7g/L琼脂，培养温度为4℃；

6）取步骤5）预培养过的茎尖放入加载液中，加载液为MS培养基加2mol/L甘油、1mol/L蔗糖，pH=5.8，室温下加载20-40min；

7）取加载过的茎尖转移到PVS2溶液中，在冰上操作，处理30-50min；

8）用移液枪吸取PVS2溶液在铝箔盒打液滴，将步骤7）茎尖放入液滴中，将带液滴的铝箔盒放入液氮中处理30min，立即进行40℃水浴化冻处理0.2-1.5min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；再快速投入卸载液中20min，卸载液为MS培养基加入1.2mol/L蔗糖；

9）将茎尖取出放到后培养基中，0℃下暗培养5-7天，光照强度200lux的弱光培养1个月，获得太子参再生植株；

10）利用RT-PCR技术进行太子参再生植株的BBMV检测，获得脱除太子参蚕豆萎蔫病毒BBMV的株系；

其中，PVS2溶液为MS培养基加入终浓度为30% W/V甘油、15% W/V聚乙二醇、15% W/V二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖，pH=5.8。

2.根据权利要求1所述的一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法，其特征在于：初代培养基为：MS培养基加入0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、6.8g/L琼脂，pH=5.8。

3.根据权利要求1所述的一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法，其特征在于：继代培养基为MS培养基+ 30g/L蔗糖+7g/L琼脂。

4.根据权利要求1所述的一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法，其特征在于：步骤9）后培养基为MS培养基加入0.05mol/L赤霉素、7g/L琼脂，30g/L蔗糖。