[发明专利]一种用于快速检测犬心丝虫与焦虫的引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于快速检测犬心丝虫(Dirofilaria immitis)与焦虫(Babesia spp.)的引物组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域；本发明将重组酶‑多聚酶的核酸扩增技术与荧光检测技术相结合，专一性侦测犬心丝虫与焦虫的遗传物质DNA，不会与其他犬寄生虫产生交叉反应，本发明提供一个简单、快速、不须昂贵设备即可现场进行犬心丝虫与焦虫感染的筛检方式，具有高灵敏度、特异性的特点，适用于即时快速诊断，一次反应即可分别鉴定出犬心丝虫与焦虫，可为宠物提供第一线的快速检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种用于快速检测犬心丝虫与焦虫的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

犬心丝虫症的病原为心丝虫(Dirofilaria immitis)，犬心丝虫的中间寄主为中华按蚊、白纹伊蚊、淡色库蚊等多种蚊，犬类由于被含有感染性幼虫的蚊叮咬而遭感染。心丝虫的成虫寄生于犬猫和人类的右心与肺动脉处，成虫会产下幼虫，(雌虫直接产生幼虫，成为微丝蚴)于血液中循环，蚊子叮咬感染心丝虫症的犬猫后即携带心丝虫的幼虫，幼虫于蚊子唾液腺蜕变成为具感染力的幼丝虫，再经由蚊子叮咬其他犬猫和人类而感染。犬猫可重复感染本病。由于成虫寄生于心脏内，造成心脏破坏，逐渐影响犬猫和人类健康，罹病之初犬猫无明显不适，但感染一段时间后，逐渐出现运动不耐、咳嗽、呼吸急促，过去常被误诊为气管炎或普通心脏病。后期则出现心肺衰竭、贫血、肺积水、腹水、黄疸、肝肾衰竭死亡。因此，心丝虫症的早期筛查极为重要。

焦虫(Babesia spp.)可经由壁虱(Ticks)或输血而感染，在免疫抑制的状况下，会增加感染的危险性。犬焦虫感染主要是导致红血球的破坏及贫血，包括俗称大焦虫的Babesia canis，及俗称小焦虫的Babesia gibsoni。大焦虫的长度在4～7μm，呈西洋梨形状，成犬除非在免疫抑制的状况下才会造成严重的临床症状，一般都仅显现轻微或不明显的临床症状，但对幼犬而言则严重多了，目前在中国台湾南部较为常见。小焦虫(2.5μm)外观呈小圆圈状，大部份感染的成犬都会引发严重的临床症状：昏睡不活泼、厌食、黏膜苍白、发热、呕吐、琥珀色至褐色尿、脾脏肿大、黄疸、体重减轻、呼吸加快、心跳加快。因此，犬焦虫的早期筛查对宠物的健康发育起着第一线的防护作用。

目前，检验犬心丝虫与焦虫感染常用的方法是以血液涂片后在显微镜下观察，但其灵敏度不佳，并且漏检率极高。心丝虫成虫抗原检测试剂盒也常用来筛查血液中的心丝虫抗原，但其灵敏度与特异性均不佳，假阴性率较高。犬心丝虫与焦虫的分子检验主要是以Real time-PCR法，检测血清中的寄生虫核酸，此法虽然专一性与灵敏度高，但是检测时间需要至少 60-90min，且需要复杂仪器，并不适用于定点照护检测(point-of-care test，POCT)使用。因此，亟需研发一种能够快速准确、简易、无须贵重仪器、可用于现场快速检测犬心丝虫与焦虫的试剂盒及检测方法。

发明内容

发明的目的在于提供一种用于快速检测犬心丝虫与焦虫的引物组、试剂盒及检测方法，解决了背景技术中的问题。

本发明采用重组酶-多聚酶的核酸扩增技术与荧光检测技术，可为宠物提供第一线的快速检测，并且可细分犬心丝虫、大焦虫与小焦虫，以提供医疗确诊，并且专一性高，不会与其他犬寄生虫产生交叉反应，具有高灵敏度和特异性的特点。

根据本发明一个方面，提供了一种用于快速检测犬心丝虫与焦虫的引物组，所述引物组在适宜的引物浓度条件下，可以互不影响的在一次扩增中同时检测犬心丝虫、大焦虫与小焦虫。

本发明是这样实现的，一种用于快速检测犬心丝虫与焦虫的引物组，该引物组为一套犬心丝虫与焦虫特征性引物组，所述一套犬心丝虫与焦虫特征性引物组由三对引物组成，所述三对引物分别为引物对一、引物对二和引物对三，每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，

所述引物对一为检测心丝虫的引物对，所述引物对二为检测大焦虫的引物对，所述引物对三为检测小焦虫的引物对，