[发明专利]一种高编辑效率SaCas9基因及其应用

说明书

本发明提供了一种高编辑效率的SaCas9基因及其应用。本发明通过优化密码子设计合成了一种在水稻转基因过程中高编辑效率的SaCas9基因。并且本发明还提供包含该SaCas9基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的SaCas9基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切。本发明实现了水稻基因打靶，并且更加适合用于水稻基因打靶，尤其是水稻的基因组剪切。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高编辑效率的SaCas9基因的应用，尤其是在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

基因组编辑技术是植物基因功能研究和进行作物改良的有力工具，其主要依赖人工内切核酸酶(SSNs)在目标基因组位置产生双链断裂(DSBs)，DSBs可以通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)进行修复。通过NHEJ的修复容易发生错误，使断裂位置产生小片段的缺失或插入，从而导致基因突变；在有供体DNA存在的情况下，有可能通过HDR进行断裂位置的修复，产生精准的基因插入或替换。在基因工程中多使用的基因编辑系统是CRISPR-SpCas9系统。该系统识别靶点时需要特定的NGG序列，因此在一定程度上限定了基因编辑系统的应用范围。同时SpCas9基因较大(4kb)，可能对细胞导入效率带来一定影响。

通过使用SaCas9可以一定程度降低SpCas9的局限性。SaCas9可以识别NNGRRT特征的PAM序列，同时大小较SpCas9也有显著降低。但现在使用的SaCas9是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，其不仅表达效率有限还会带来安全性的风险和担忧。具体而言，由于SaCas9来自于大肠杆菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

而且现有的SaCas9若直接使用，其在真核细胞中的表达效率也偏低，从而影响其对DNA双链的切割效率。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种高编辑效率的、非提取自大肠杆菌的SaCas9基因。

本发明的申请人经过大量实验获得了一种能够在水稻转基因打靶过程中，实现高编辑和剪切效率的SaCas9基因，并整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种高编辑效率的SaCas9基因，其特征在于，所述高编辑效率的SaCas9基因，SaCas9基因至少包含：

(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者

(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的；或者

(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的。

优选地，所述高编辑效率的SaCas9基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含所述的SaCas9基因。

另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含所述的SaCas9基因或所述的表达盒。

另一方面，本发明提供一种所述的基因、所述表达盒或所述载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述高编辑效率的SaCas9基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。