[发明专利]基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法在审
| 申请号： | 201910155616.9 | 申请日： | 2019-03-01 |
| 公开（公告）号： | CN109966506A | 公开（公告）日： | 2019-07-05 |
| 发明（设计）人： | 段莉;梁宇杰;李兴福;徐晓;王大平;夏江 | 申请（专利权）人： | 深圳市第二人民医院 |
| 主分类号： | A61K47/46 | 分类号： | A61K47/46;A61K31/7105;A61P19/02;A61P19/04;A61P29/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) 11531 | 代理人： | 马金华 |
| 地址： | 518000 广东省深*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 靶向 基因工程改造 骨性关节炎 靶向治疗 递送 治疗骨性关节炎 关节软骨破坏 治疗骨关节炎 组织特异性 递送药物 分解代谢 软骨基质 软骨细胞 软骨修复 软骨组织 重组质粒 靶向肽 软骨 构建 降解 修饰 运载 治疗 运输 应用 | ||
1.基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：构建质粒：利用携带软骨细胞的亲合肽(CAP)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向软骨细胞；
步骤二：在DC细胞中表达质粒CAP-lamp2b，筛选稳定细胞株；
步骤三：利用无外泌体的培养基扩增稳定表达CAP-lamp2b细胞，收集细胞上清液，进行差异超速离心分离获取靶向外泌体；
步骤四：通过电穿孔仪把miRNA-140电转到步骤三中所获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上miRNA，运载miRNA-140；
步骤五：通过关节腔注射软骨细胞靶向外泌体，从而在实现miRNA-140靶向递送到关节软骨细胞里用于骨关节炎实验。
2.根据权利要求1所述的基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于：所述步骤二中靶向外泌体的具体制备步骤如下：
a：设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR纯化；
b：将步骤a中PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag上，构建成pCMV-lamp2b质粒；
c：再将的软骨细胞亲和肽的核酸DNA序列插入到步骤b所构建的质粒pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b；
d：将步骤c中的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系；
e：在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，离心去除死细胞及细胞碎片，通过高速离心法分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，主要步骤如下：提取上清液10000g，4度离心30分钟；0.22微米膜过滤后，100000g，4度，离心70分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀，100000g，4度，70分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体。
3.根据权利要求1-2所述的基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于：所述软骨细胞亲合肽的氨基酸序列如下：DWRVIIPPRPSA。
4.根据权利要求1-2所述的基因工程改造外泌体递送miRNA-140靶向治疗骨性关节炎的方法，其特征在于：所述软骨细胞亲合肽的核酸DNA序列如下：GACTGGAGGGTGATCATCCCCCCCAGGCCCAGCGCC。
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