[发明专利]一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法

说明书

本发明公开了一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法，包括底卡和面卡，所述底卡上设有：所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；所述述结合区、检测区、废液区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀。本发明通过微流控技术控制待测样品的流速和流量，具有同一种标志物的肿瘤干细胞通过一条微通道进入检测区，避免相互干扰，从而减少误差，增加反应灵敏度；将待测样品制备成水包水微液滴，增大检测限度。

技术领域

本发明涉及微流控技术和免疫荧光微球免疫层析技术相结合的技术领域，具体涉及一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法。

背景技术

近年来随着生物和医学技术的发展，在肝癌组织、肺癌组织、乳腺癌以及直肠癌等多种恶性肿瘤组织中均可以分离出肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。肿瘤干细胞是参与调控癌细胞增殖与自我更新，以及维持肿瘤生长的一类在肿瘤组织中含量很少的细胞。肿瘤干细胞和正常组织干细胞在特征上存在诸多的相似性，包括自我更新、多向分化、细胞周期较长等。

微流控技术(Microfludics)是指在至少有一维为微米甚至纳米尺度的低维通道结构中控制体积为皮升至纳升的流体进行流动并传质、传热的技术。实现微流控操控的主要方法就是将流体限制在一个微米甚至纳米尺度的通道中，流体在微流控的微通道中具有独特的流体性质，如层流、液滴等等。当微通道在微米甚至纳米尺度时，微通道表面积与其内部体积比很大，通道的结构、形状和壁面性质都对流体的流动状态产生极大影响。因此，微流控可以实现一系列常规方法难以完成的微加工和微操作。时间阀的作用就是在固定的时间内控制通过微通道的流体的流速和流量，可以严格控制整个反应的时间并且控制进入检测区的流体量，并且时间阀的孔径尺寸可以设置为循环肿瘤干细胞的尺寸，只能循环肿瘤干细胞通过其他干扰物质无法通过。。

荧光微球是指将荧光团通过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能，具有相对稳定的形态结构以及发光行为。荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。

水包水微液滴技术即将富含1.5wt％葡聚糖、0..5wt％海藻糖和0.5wt％明胶加入到不混溶的6.5wt％聚乙二醇的水相中形成原纤维网络，为了增加原纤维网络的吸附作用，加入1wt％鸡蛋清溶菌酶在60℃进行热孵化，原纤维网络转化为成熟的原纤维，再用该成熟的原纤维包裹直径为8μm的的微液滴形成水包水微液滴，使微液滴表面积增加了60％而没有破裂，极大的增加了检测限度，比普通Elisa方法的检测限度增大了1000倍。水包水微液滴具有高度稳定的特异性，避免使用可是蛋白变性的有机溶剂。

目前已经明确的肝癌干细胞标志物包括CD133，CD90，CD44，CK19，CK7以及CD133等。CD133蛋白是在人类造血干/祖细胞上发现的一种跨膜糖蛋白，起初被认为是造血干细胞的特异性表面标志物，后来经研究发现该蛋白不仅仅在神经干细胞、表皮干细胞等干细胞中有表达，在各种肿瘤干细胞中也均有表达；CD44蛋白属于在细胞表面广泛表达的糖蛋白，与细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用有关，Camerlingo R等通过流式细胞术筛选出57位乳腺癌病人肿瘤组织细胞中的CD44+细胞，并经鉴别实验证明此类细胞表达有干细胞样特性；CD 90是一种葡萄糖6磷酸异构酶锚定的糖蛋白，与CD44一样参与胞间的相互作用。CD 90主要表达与肝脏干细胞的表面，然而在成人的肝脏中表达稀少；ALDH1是乙醛脱氢酶(ALDH)家族之一，是催化细胞内的乙醛氧化为乙酸的细胞溶脂酶，是参与乙醇分解的一种重要蛋白。近年来，研究发现ALDH1可能作为肺癌干细胞标志物，并用于白血病干细胞的鉴定与分离。