[发明专利]一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针

说明书

本发明提供一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针，分别设计针对绵羊肺炎支原体特异性检测引物Mo‑F、Mo‑R及一条荧光探针Mo‑P，针对丝状支原体山羊亚种的特异性检测引物Mmc‑F、Mmc‑R及探针Mmc‑P，针对山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性检测引物Mccp‑F、Mccp‑R及荧光探针Mccp‑P。本发明提供的三重荧光定量PCR方法可以同时检测和鉴别绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种和丝状支原体山羊亚种3种支原体，具有快速、准确、特异性强、重复性好等优点，同时还可节约成本，适用于对以上3种支原体的快速检测及其所引起的羊支原体性肺炎和山羊传染性胸膜肺炎的流行病学调查。

技术领域

本发明涉及一种检测3种羊致病性支原体的三重荧光定量PCR引物和探针，属于预防兽医学技术领域。

背景技术

近年来，我国新疆、辽宁、河北、四川、重庆、广西、贵州、湖南、福建等多个省份流行羊支原体性肺炎，其病原主要是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumonia，Mo)和丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp .capri ,Mmc)。近几年有多位学者报道同一羊群中出现两种以上支原体的混合感染现象,然而这两种病原引起的临床症状相似，病理变化相近,临床上难以区别，给疾病的确诊带来了极大困难。这两种病原是我国当前养羊业的主要疫病，给我国养羊业造成了巨大的经济损失。

绵羊肺炎支原体是羊支原体性肺炎的病原之一，主要临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症, 临床上呈急性或慢性经过，病死率一般为30%～50%, 有的高达80%～100%。绵羊肺炎支原体培养困难，目前羊支原体性肺炎仍缺乏有效的生前诊断和防治措施，给养羊业造成巨大经济损失。目前, 该病广泛分布于世界各养羊地区, 尤其是亚洲和非洲国家。

丝状支原体山羊亚种是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎的病原之一。可引起山羊以高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。

山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp），也是丝状支原体簇的成员，是山羊传染性胸膜肺炎的病原。山羊传染性胸膜肺炎是山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病，以呈现纤维素性肺炎和胸外膜炎为特征。该病发病率可高达80～100%，死亡率达60～80%。Mccp最早是由Macowan于1976年在肯尼亚分离得到。随后又在苏丹、突尼斯、阿曼、土耳其、乍得、乌干达、埃塞俄比亚、尼日尔、坦桑尼亚和阿联酋分离到。我国最早于2007年从山东分离出１株Mccp。

由于Mccp和Mmc同属丝状支原体簇，丝状支原体簇成员间基因组序列高度同源（16SrRNA基因同源性为95.5%），生化性状相近，血清学存在广泛交叉反应，因此，建立鉴别Mccp和Mmc的检测方法难度很大。当前确诊山羊传染性胸膜肺炎和羊支原体性肺炎的方法主要是病原分离鉴定, 但是支原体的体外培养成本较高, 培养条件要求苛刻，生长缓慢，尤其是Mccp很难培养，临床病例确诊一般需要2-3周时间, 显然不能满足快速诊断的需要,所以，临床上迫切需要建立能够鉴别绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的诊断方法。PCR 是快速诊断疫病和进行流行病学研究的重要技术, 国外一些学者应用该技术对山羊传染性胸膜肺炎进行了诊断和流行病学研究, 国内的屈勇刚等、李媛等、储岳峰等分别建立了绵羊肺炎支原体PCR 检测方法及绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种二重PCR 检测方法, 但目前关于绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种和丝状支原体山羊亚种这3种病原的分子生物学诊断方法主要有单一PCR、双重/三重PCR和单一/双重荧光定量PCR方法,尚未见有三重荧光定量PCR同时检测这3种病原的报道。本发明提供快速、特异、灵敏的鉴别或同时检测3种羊致病支原体的三重荧光定量PCR方法, 适用于临床快速检测和大规模流行病学调查，有广阔的应用前景，具有重大的经济和社会效益。

发明内容