[发明专利]一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体

说明书

本发明提供了一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体。具体地，本发明提供了一种用于编辑昆虫细胞基因的试剂，所述试剂包括靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体。本发明的避免了使用化学农药，保护了环境，保障了食品安全，且产生的害虫不易产生耐药性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术是近年发展起来的新型高效基因编辑技术，来源于对细菌免疫机制的研究。在噬菌体感染细菌的过程中，细菌把噬菌体核酸的部分片段整合到自身基因组中，并进化出Cas(CRISPR-associated)核酸酶。当噬菌体再次感染时，Cas核酸酶在这些片段(称为gRNA)的引导下结合到噬菌体核酸的相应部位并切割核酸，从而阻止噬菌体的侵染。研究人员利用此原理，发展了一种基因编辑技术，即通过gRNA引导Cas9核酸酶到目的基因的把序列上，Cas9切割双链DNA，通过非同源末端连接机制引入缺失插入等突变，从而破坏基因功能。

CRISPR/Cas9基因编辑技术需要相应的载体来实现。基本过程是从化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中得到Cas9基因序列并经过特定表达宿主密码子优化后克隆到相应的表达载体，以及克隆小RNA启动子驱动的gRNA骨架序列到同一表达载体。

CRISPR/Cas9基因编辑技术对靶基因编辑位点的选择是由gRNA确定的，而gRNA的设计需要遵循一定的规则。第一，转录起始碱基为鸟嘌呤G；第二，中间序列长度为20个碱基；第三，靶基因中与上述20个碱基区域下游三碱基必须为NGG，称为PAM序列，其中N代表任一碱基。

农业害虫控制是农业生产中一个非常重要的环节。对种植业来说，我国目前普遍使用化学农药，保证了粮食及果蔬的供给，但在其生产与使用过程中同样对人体健康、生态环境及物种多样性造成了深刻的影响，因此本领域迫切需要开发新的农业害虫控制手段。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体。

在本发明的第一方面，提供了一种用于编辑昆虫细胞基因的试剂，所述试剂包括：

(i)靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体；和

任选的(ii)表达Cas9蛋白或表达Cas9蛋白的表达盒。

在另一优选例中，所述昆虫为小菜蛾、二化螟。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白基因为ABCH1。

在另一优选例中，所述sgRNA包括含有其对应识别区序列的核苷酸。

在另一优选例中，所述sgRNA的序列为sgRNA识别区序列或相应的全长sgRNA序列。

在另一优选例中，所述sgRNA的序列包括选自下组的序列：(1)sgRNA识别区序列；或(2)相应的全长sgRNA序列。

在另一优选例中，所述的全长sgRNA序列从5’端至3’端依次含有sgRNA识别区序列和sgRNA框架序列。

在另一优选例中，所述sgRNA识别区序列具有SEQ ID NO.:1(GTCGCCGCCGGGCGACGAGA)所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述sgRNA框架序列具有SEQ ID NO.:2(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC)所示的核苷酸序列。