[发明专利]一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种兔波氏杆菌外膜蛋白，其特征在于，该外膜蛋白为外膜蛋白PPP或外膜蛋白PL，所述外膜蛋白PPP包含：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL包含：如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

2.用于制备如权利要求1所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的引物序列，其特征在于，所述外膜蛋白PPP的引物序列包含：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL的引物序列包含：如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

3.一种如权利要求1所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(1)以提取的兔波氏杆菌HB菌株的基因组DNA为模板，以权利要求2中所述的外膜蛋白PPP的引物序列或外膜蛋白PL的引物序列作为引物，采用PCR分别扩增靶蛋白PPP或PL的基因；

(2)将扩增的目的基因与PMD-18T连接，并转化感受态细胞，检验阳性克隆，提取阳性细胞的重组质粒；

(3)将提取的重组质粒和pET-28a(+)质粒用Nco I和Xho I限制性内切酶双酶切，以连接酶连接，将连接产物转化入感受态细胞中，提取质粒，获得构建的pET-28a(+)/PL或pET-28a(+)/PPP重组质粒；

(4)鉴定步骤(3)获得的重组质粒，将阳性重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，诱导剂IPTG诱导重组蛋白PPP或PL的表达；

所述重组蛋白PPP为如权利要求1中所述的外膜蛋白PPP；所述重组蛋白PL为如权利要求1中所述的外膜蛋白PL。

4.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(2)和(3)中，所述感受态细胞为top10感受态细胞。

5.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述检验阳性克隆采用菌液PCR方法。

6.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，以T4连接酶连接，将连接产物转化入Top10感受态细胞中，将菌液转移至无抗性的LB液体培养基中，37℃，180～200r/min培养，使细胞恢复抗性，取菌液涂于含相应抗生素抗性LB琼脂平板上，于37℃培养12～16h，用试剂盒法提取菌液质粒。

7.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，将阳性重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，转移菌液至无抗生素的LB液体培养基，37℃，180～200r/min培养，使细胞恢复抗性，将菌液涂于含卡那抗性的平板，倒置平皿于37℃培养12～16h；接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，直至对数生长期，加入IPTG诱导培养。

8.一种兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有如权利要求1中所述的外膜蛋白PPP，和/或所述外膜蛋白PL。

9.根据权利要求8所述的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL，外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL比例为1：1。

10.一种兔波氏杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，该方法采用如权利要求8或9所述的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，1μg/mL的外膜蛋白PPP和1μg/mL的外膜蛋白PL，37℃包被2h；血清稀释度为1：400，作用条件为37℃，1h；5％脱脂乳为封闭液于37℃静置2h；二抗的最佳稀释度为1：5000，作用条件为37℃。