[发明专利]肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒

说明书

本发明涉及一种肺炎支原体(MP)快速检测引物组、试剂盒，所述肺炎支原体快速检测引物组包括检测肺炎支原体基因组P1基因序列的上、下游引物和探针；所述试剂盒包括以下内容：裂解液、复溶液、含引物探针的EMA反应管、阳性质控品、阴性质控品。本发明提供的引物组能与肺炎支原体P1基因特异性结合，配合EMA(Enzymes Mediated Amplification，多酶介导的核酸扩增技术，即常温核酸扩增技术)制备成肺炎支原体检测试剂盒，具有操作简单、耗时短、灵敏度高、特异度高等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)，属柔膜体纲，支原体属，是介于细菌和病毒之间，能在无生命培养基上独立生活、能够进行自我复制的原核微生物。肺炎支原体可通过咳嗽时飞沫或气溶胶以及直接接触传播，对人类普遍易感，但是发病呈现低龄化趋势，尤其是免疫系统发育尚未成熟的儿童和青少年。肺炎支原体可导致急性肺部感染，是儿童和成人社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)的重要病原体。儿童CAP中10％-40％由MP感染所致，其中约18％需要住院治疗。除了肺炎，肺炎支原体也可引起多种肺μ并发症包括神经、心血管等多系统疾病，甚至死亡。由于肺炎支原体没有细胞壁，寻常抗生素对其治疗效果不佳，因此，为避免滥用抗生素，早期诊断尤为重要。

目前，针对肺炎支原体的检测方法，主要包括快速培养法、荧光PCR法和血清学检测法。其中荧光PCR法因其灵敏度高、特异度高等优势，越来越广泛的应用于临床肺炎支原体感染检测。国内外已报道多种肺炎支原体荧光PCR检测体系，包括荧光定量PCR法、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等，检测灵敏度和特异度均已经超过其他检测技术，逐渐成为临床肺炎支原体检测的“金标准”。但是，荧光PCR法也存在一些缺点，包括依赖于成本高昂的荧光PCR仪及复杂的实验设计，同时对实验技术人员操作要求较高，耗时长等，同时需要变温循环容易产生气溶胶，具有污染的风险。LAMP技术需要65℃恒温，这个温度也是相对较高的，存在污染可能性较大、假阳性、特异度低等缺点。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒，操作简单、耗时短、灵敏度高、特异性强，准确度高，不易出假阳性，能够快速而准确地检测肺炎支原体。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：肺炎支原体快速检测引物组，包含检测肺炎支原体基因组P1基因保守序列的上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-GGCAGTCAACAAACCACGTATGATCCC-3’；所述下游引物是：5’-AAACGGCAAACCGATAAGGATTGGAGG-3’；所述探针是5’-GCCGGGCGCGCCTTATACGACC/i6-FAMdT/C/idSp/A/iBHQ1dT/TTTTCGAAGT-3’C3Spacer。其中：“i6-FAMdT”指6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”指带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3Spacer”指3’羟基封闭。

进一步的，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失及BHQ1修饰处于序列的第23、25及27位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于正向或反向互补序列的第21-32位。

进一步的，所述探针长度有34bp，荧光、碱基缺失和淬灭修饰处于序列中下游第23、25及27位。