[发明专利]基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA特异性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

设计启动引物：所述启动引物与cccDNA正链配对，所述与cccDNA正链配对的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域的下游；

第1步PCR反应：加入所述启动引物，以cccDNA正链为模板，开始单向PCR反应，得到新生的单链DNA分子；所述新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基；所述的通用碱基是可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基；所述第1步PCR反应在rcDNA中缺乏完整的正链DNA模板，无法开始扩增；

设计选择引物：所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域上游；

第2步PCR反应：加入所述选择引物，对第1步PCR反应中所述新生的单链DNA分子进行选择性扩增，得到选择性扩增的产物；所述的选择引物能够与新生的单链DNA分子配对，但是不能与cccDNA的互补序列配对；

定性或定量检测第2步PCR反应中所述的选择性扩增的产物。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，在第1步单向PCR反应体系中，加入的脱氧核苷三磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的任意3种，和1种通用碱基脱氧核苷三磷酸；在这一步的PCR延长反应中，DNA聚合酶催化通用碱基插入新生的DNA链，新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基。

3.根据权利要求1所述的非诊断目的的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述通用碱基选自：次黄嘌呤、嗅尿嘧啶、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或7-氮杂吲哚。

4.根据权利要求1～3任一项所述的非诊断目的的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，在第1步单向PCR反应体系中，加入dATP、dTTP、dCTP和次黄嘌呤脱氧核苷三磷酸（dITP）；在这一步的PCR延长反应中，DNA聚合酶催化次黄嘌呤脱氧核苷插入新生的DNA链，新生的单链DNA分子中的碱基G被替换为I；和/或

在第2步选择性PCR反应体系中，加入的选择引物是用腺嘌呤A与新生的单链DNA分子中对应位点的I进行配对，可以启动选择性扩增得到产物；选择引物不能与对应位点为胞嘧啶C的目标单链DNA互补序列进行配对。

5.根据权利要求1～3任一项所述的非诊断目的的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，

所述启动引物选自：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23；和/或

所述选择引物选自：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30。

6.根据权利要求1～3任一项所述的非诊断目的的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述定性或定量检测的方法包括：电泳法、荧光染料法、荧光探针法、荧光原位杂交法。

7.根据权利要求6所述的非诊断目的的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述定性或定量检测中，检测用的探针的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.31、SEQID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35；

所述探针标记有荧光基团和淬灭基团。

8.一种HBV-cccDNA的特异性检测试剂盒，其特征在于，包含有：引物、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、通用碱基脱氧核苷三磷酸；

所述引物包括：如权利要求1～7任一项所述的启动引物和选择引物。