[发明专利]一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用，提供在人血浆复杂生理环境中能够高特异性识别、高亲和力结合上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，发展了以人血浆模拟复杂生理环境的核酸适体筛选方法，可获得直接应用于外周血中捕获CTCs的核酸适体；最终获得的核酸适体具有易获得、成本低、不易失活、非免疫原性和无毒性等特点，并且利用该些序列实现了EpCAM蛋白、表达EpCAM蛋白的肿瘤细胞系的特异性识别及CTCs的捕获；另外，该些核酸适体在人血浆中具有高亲和力，确保其在生物分析和临床医学中的应用，并有望作为CTCs检测的分子识别工具而应用于液体活检。

技术领域

本发明属于生物分析和临床医学技术领域，具体涉及一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用。本发明具体提供了在人血浆复杂生理环境中能够高特异性识别、高亲和力结合上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体与其筛选方法及其在生物分析和临床医学中的应用，并有望作为循环肿瘤细胞检测的分子识别工具而应用于液体活检。

背景技术

癌症已严重威胁人类生存和健康，成为全球死亡的主要原因。针对癌症的早期诊断和预后评估是提高患者生存率的重要保障。传统的癌症体外检测是组织活检，但是存在着取样困难、侵入性大等不足，难以满足临床需要。目前，针对循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cells，CTCs)的液体活检尤为受到关注。CTCs是指由实体肿瘤组织脱落并释放进入外周血循环的肿瘤细胞，其可提供肿瘤病灶的基因组变异、细胞形态与功能改变等信息，更能全面反映肿瘤病灶的分子病理信息。与经典组织活检相比，基于CTCs检测的液体活检技术具有侵入性小、无放射性污染、成本低等优势，已成为目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段之一。大量研究证明，CTCs的检测在肿瘤诊断、动态监测、预后评估等方面具有重大意义。

上皮细胞粘附分子EpCAM在大部分上皮肿瘤细胞中过表达，在上皮癌变过程中发挥着作用，参与调节细胞粘附、细胞迁移、增殖和分化等功能，是一种腺癌通用肿瘤标志物。利用CTC表面表达的EpCAM，通过抗原抗体反应来捕获和分选CTCs，在肿瘤诊断、动态监测、预后评估等方面具有重大意义。例如，目前美国食品药物管理局批准的循环肿瘤细胞捕获平台Cellsearch就是基于EpCAM抗体修饰的磁珠来捕获全血中的CTCs，实现CTCs的分离富集。但是由于EpCAM抗体存在不稳定、易失活、成本高、寿命短以及大尺寸等缺点，导致CTCs的捕获效果不甚理想。因此，需要更小、更稳定和更有效的CTCs标志物的结合配体进行CTCs捕获。

核酸适体，是一种寡核苷酸，通过体外指数富集配体系统进化技术(SELEX)从人工合成的DNA、RNA文库中筛选得到，经折叠形成特定的三维或者四维结构后，可与靶标分子，例如与多肽、蛋白质、药物、有机和无机分子甚至全细胞，高亲和性、特异地结合。相比于抗体，核酸适体具有易获得、成本低、纯度高、不易失活、更稳定、非免疫原性和无毒性等特点。且因核酸适体比抗体小10～20倍，因此在相同表面积下可修饰更多的识别分子，从而进一步提高CTCs捕获效率。由于核酸适体具有上述特性以及结构可调等特点，用核酸适体取代传统抗体具有巨大的优势，可实现特异性捕获CTCs，有望获得较高的CTCs捕获效率。

但是，传统核酸适体筛选方法所筛选出的核酸适体，应用于复杂生理环境中捕获循环肿瘤细胞时，易受到反应体系的影响，核酸适体二级、三级结构不稳定，而导致亲和力稳定性不好，难以实现真实样品中CTCs的高效捕获。为实现核酸适体直接用于血液中富集CTCs，需要建立新型高效可用于复杂生理环境的核酸适体筛选方法，筛选针对CTCs标志物上皮细胞粘附分子EpCAM且在人血浆等复杂生理环境中更稳定、亲和力和选择性更高的核酸适体，实现CTCs特异性识别，提高CTCs捕获效率，对于肿瘤诊断、动态监测、预后评估等都具有重要意义。

发明内容