[发明专利]一种制备小分子透明质酸或其盐的方法

权利要求书

1.一种制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）酶解反应液：向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，通过酶解反应得酶解液，所述透明质酸酶为植物乳杆菌诱变菌株CnT012-56发酵生产制得，该菌株分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月28日，保藏编号：CGMCC NO. 16836；

（2）透明质酸酶灭活：将步骤（1）酶解液升温处理，使所述酶解液中透明质酸酶变性失活；

（3）吸附：将步骤（2）中酶解液进行吸附；

（4）过滤纯化：将步骤（3）混合液去除吸附剂及其变性透明质酸酶，过滤得到纯净小分子透明质酸及其盐溶液；

（5）低温喷雾干燥：将步骤（4）小分子透明质酸及其盐溶液进行低温喷雾干燥，得到所需分子量的小分子透明质酸及其盐固体粉末；

其中，步骤（1）中首先向纯化水中加入透明质酸酶，开启搅拌，调节pH为5-8，温度为30-40℃，缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，使质量体积浓度达到50-100g/L，降解反应0.5-1.5h后，继续缓缓加入透明质酸或其盐固体粉末，使质量体积浓度达到100-200g/L，继续酶解5-8h；

步骤（1）中透明质酸酶添加量为每克透明质酸或其盐加10²-10⁵ IU；

步骤（5）中喷雾干燥法制备小分子透明质酸或其盐固体粉末条件为进风温度40℃-80℃，出风温度40℃，进料速度100mL/h – 300mL/h；

上述植物乳杆菌诱变菌株生产的透明质酸酶的生产方法，具体包括以下步骤：

（1）将Lactobacillus plantarum CnT012-56菌种接种到已灭菌的种子培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-100rpm，培养8-24h，获得种子培养液；

（2）将种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-150rpm，培养20-48h，获得透明质酸酶发酵液；

（3）离心上述透明质酸酶发酵液，取上清液；

（4）孔径截留分子量200kDa的超滤膜，超滤上述透明质酸酶上清液，取滤过液；

（5）孔径截留分子量20kDa的超滤膜，超滤上述滤过液，除去小分子杂质，得到纯化的透明质酸酶。

2.根据权利要求1所述制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于：步骤（2）中透明质酸酶变性失活条件为酶解液升温至45-80℃下维持5-60min 。

3.根据权利要求1所述制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于：步骤（3）中酶解液吸附条件为0.01%-1%活性炭，吸附30-90min，步骤（4）中采用孔径0.22μm的纤维素滤膜过滤。

4.根据权利要求2所述制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于：透明质酸盐固体粉末为透明质酸钠，pH调节用盐酸或氢氧化钠溶液调节。

5.根据权利要求1所述制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于：步骤（4）中小分子透明质酸或其盐溶液最终浓度为10% - 20%。

6.根据权利要求1所述制备小分子透明质酸或其盐的方法，其特征在于：步骤（1）中酶解用透明质酸或其盐的分子量介于500kDa -700kDa，步骤（5）中制得小分子透明质酸或其盐的分子量介于1kDa-60kDa。