[发明专利]一种用于分离循环肿瘤细胞的磁性纳米短纤维的制备方法

说明书

本发明涉及一种用于分离循环肿瘤细胞的磁性纳米短纤维的制备方法，包括：水热法制备Fe₃O₄@PEI，通过静电纺丝制备Fe₃O₄@PEI/PVA磁性纳米纤维膜，均质处理得到Fe₃O₄@PEI/PVA磁性纳米短纤维，短纤维表面修饰DNA适配体作为靶向分子，用于癌细胞的高效捕获和磁分离。本发明制备工艺简单，原料廉价易得，可以简单、快速实现癌细胞的高效捕获和无损释放，在细胞分选领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞分选领域，特别涉及一种用于分离循环肿瘤细胞的磁性纳米短纤维的制备方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从原发灶实体瘤上脱落进入血液循环系统的癌细胞。研究表明，CTCs与癌症的转移和复发密切相关，且癌症病人外周血中CTCs的数量与癌症的分期密切相关，还可以反映癌症的治疗效果。检测和分析CTCs对于癌症的早期诊断、疗效评估、预后判断和个体化治疗具有极其重要的意义。但是血液中CTCs数目极少，每毫升血液中的血细胞超过10⁹个，而CTCs只有几个到几百个，因此采用常规手段难以实现CTCs的捕获和分离。

目前，针对CTCs的捕获和分离的方法主要有基于细胞尺寸差异的过滤分离方法、密度梯度离心法、磁分离技术、电化学分选、微流控技术以及基于各种纳米基底的免疫识别分离方法。其中，细胞磁分离技术一般是通过表面连接有靶向配体的磁性材料与含有靶细胞的细胞悬液共同孵育一段时间，然后利用外部磁场分离出靶细胞的方法。该方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出目标细胞，简便、快速实现目标细胞的分离和纯化，因而在基础科学研究和临床应用中得到广泛关注。但是，常见的CTCs磁分离方法大多只用于CTCs的捕获和分离，分离出的CTCs被磁性材料紧密包覆，不利于后续对CTCs的检测和分析。例如，被FDA认证的CellSearch系统就是采用免疫磁珠磁分离的方法实现CTCs分选，该系统仅能用于CTCs的计数，无法实现活细胞的捕获，并进行后续基因检测和用药指导。

静电纺纳米纤维具有比表面积大、生物相容性好、可模拟天然细胞外基质以及易于制备和表面功能化修饰等优点，因而可在纳米纤维表面修饰靶向配体用于癌细胞的特异性捕获。聚乙烯亚胺/聚乙烯醇(PEI/PVA)静电纺纳米纤维是一种以水为溶剂的绿色纳米纤维，且PEI/PVA纳米纤维表面带有大量的氨基和羟基便于后续的功能化修饰，可将靶向配体修饰在纳米纤维表面用于癌细胞的特异性捕获。

DNA适配体是一类能够特异性地和细胞膜表面受体结合的单链寡核苷酸序列，其亲和力与抗体相当甚至更强。由于DNA适配体本身的负电性，使其很少参与细胞的非特异性相互作用，因而具有较高的靶向特异性。同时，DNA适配体具有良好的生物相容性、稳定性、可体外合成和易于修饰等诸多优点，因而可以利用DNA核酸适配体作为靶向配体，用于CTCs的捕获和分离。此外，还可以通过DNA互补序列或者核酸酶的作用，切断DNA适配体与捕获癌细胞的靶向结合作用，实现捕获细胞的快速、无损释放。因此，DNA适配体可以作为一种理想的CTCs捕获靶向配体。

检索国内外有关磁性纳米短纤维制备的文献和专利结果表明，利用静电纺丝和均质技术制备磁性纳米短纤维及其表面修饰DNA适配体用于循环肿瘤细胞分选应用的研究尚未见相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于分离循环肿瘤细胞的磁性纳米短纤维的制备方法，该方法制备得到的磁性纳米短纤维不仅可以实现CTCs的高效捕获，而且能够快速、无损释放捕获的癌细胞。

本发明提供了一种用于分离循环肿瘤细胞的磁性纳米短纤维的制备方法，包括：