[发明专利]一种加载PD-1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用

说明书

本发明实施例公开了一种加载PD‑1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用，涉及免疫治疗技术领域，具体而言，该培养方法包括以下步骤：其包括将外周血单个核细胞与A抗培养基混合进行第一次培养；然后，将第一次培养得到的产物与B型培养基混合进行第二次培养；最后，将第二次培养后得到的产物与K型培养基混合。该培养方法能够诱导全血分离出的淋巴细胞在培养过程中向CD8+T细胞增值分化，分离出的T细胞能够在18天以内达到40倍以上的增幅，且CD8+T细胞的占比超过80％。

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，具体而言，涉及一种加载PD-1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用。

背景技术

当今癌症还是未能攻克疾病难题，2013年免疫疗法被“科学”杂志誉为最有可能治愈癌症的方法。免疫细胞治疗是免疫疗法中的重点部分，免疫细胞治疗从上个世纪70年代开始，最早的是LAK细胞(从人体抽取外周血，体外从外周血分离出淋巴细胞，加入大剂量的白介素-2进行体外培养增殖然后获得增殖数倍的淋巴细胞命名为LAK细胞，然后把培养完成的LAK细胞做成细胞悬液的制剂静脉输注人体)，LAK细胞是最早的免疫细胞体外培养后应用于癌症治疗的免疫细胞体外培养技术。

到2000年左右，新一代免疫细胞—CIK细胞应用于临床癌症治疗，其较LAK细胞体外培养技术主要是不以大剂量白介素-2刺激细胞，采用CD3单抗和多种细胞因子(白介素-2、加码-干扰素等)，但CIK细胞增值倍数低，杀伤性T细胞比例低，再针对癌症使用时疗效不明显，其培养技术上是完全培养基上添加CD3单抗激活细胞增殖，然后后续培养添加白介素-2维持细胞增殖，这样培养只能使混杂一起各种细胞都增殖，故培养完成的最主要CD8+细胞占比不高(50％左右)，由于混杂细胞存在一起各种细胞分泌不同细胞因子互相影响导致CD8+T细胞的杀伤性(细胞毒性)不强也就输注癌症病人体内所起治疗作用(对抗癌细胞作用)也不强。

之后DC细胞发现并且应用于体外培养，并且DC细胞与CIK细胞共培养而成的DC-CIK细胞，在技术上是使DC细胞提呈抗原作用刺激CIK细胞使CIK细胞更好增殖倍数和细胞功能。因此，临床疗效优于CIK细胞，但CD8+T细胞的杀伤性(细胞毒性)同样不强。

2017年，CAR-T细胞在美国获批上市，CAR-T细胞是抽取病人外周血体外分离出淋巴细胞，然后培养并使其向CD8+T细胞分化并获得一定数量，然后使用腺病毒作载体把CD19的识别基因嵌入该细胞DNA而获得嵌入特异抗原受体的T细胞命名为CAR-T细胞，该CAR-T细胞能特异识别某种类型的B细胞白血病，从而特异性攻击这种B细胞白血病的癌变细胞，把癌变细胞破坏而治疗这种白血病，并且有成功治愈个案。

2017年，PD-1抗体作为治疗癌症药物获批上市，有两家国家医药公司获得一是默沙东的K，另一是施贵宝的O药，该药物上市引起轰动，有效率最高达40％(化疗药、靶向药等癌症药物的有效率很高才百分之十几)被誉为抗癌神药。

但是，PD-1抗体能疗效只能针对一部分患者，是由于肿瘤产生了PD-L1，对于其他由于肿瘤不是由于PD-L1原因造成的，要么PD-1抗体药物是没有任何作用的，并且PD-1抗体药物具有很大的毒副作用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种T细胞的培养方法，该培养方法能够诱导全血分离出的淋巴细胞在培养过程中向CD8+T细胞增值分化，从而制备得到的杀伤性T细胞，且分离出的T细胞能够在18天以内达到40倍以上的增幅，且CD8+T细胞的占比超过80％。

本发明的第二目的在于提供一种T细胞的培养基组合，该培养基组合能够有效在短期内培养出具有大量具有杀伤力的T细胞。

本发明的第三目的在于提供一种T细胞(称为PD-1-T细胞，在培养后期加入PD-1抗体，使T细胞上的PD-1分子被PD-1抗体结合而封闭，称为PD-1-T细胞)，该T细胞具有较高的分泌细胞因子的功能，对于肿瘤细胞攻击性较强，且不受肿瘤细胞的PD-L1影响，具有能够广谱抗癌的优点。