[发明专利]一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种靶向B7H3的CAR‑T细胞的制备方法，首先准备PBMC细胞；然后将含有CAR结构的穿梭质粒LV‑B7H3、辅助质粒psPAX2和包膜质粒VSV‑G共转染293T细胞后，得到包装的B7H3‑CAR病毒；接着取PBMC细胞，采用anti‑human CD3和anti‑human CD28作为活化剂，培养活化48h后，加入B7H3‑CAR病毒进行感染，即得。该制备方案使得CAR‑T细胞IFN‑γ表达增多，细胞杀伤活性高。本发明的靶向B7H3的CAR‑T细胞对多种实体瘤细胞具有杀伤作用，杀伤活性高，并且安全有效，可用于肾癌、肺癌以及肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌等的免疫细胞治疗。

技术领域

本发明涉及一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，属于免疫学技术领域。

背景技术

嵌合抗原修饰的T细胞(ChimericAntigen Receptor modifiedT cell,CAR-T)是一种经过基因改造的T细胞，利用基因转导技术将含有肿瘤抗原特异性识别单链抗体(scFv)和T细胞激活基序的CAR导入患者T细胞，使得这些转导了CAR的T细胞能直接识别癌细胞表面抗原而活化，进而杀死癌细胞。正是因为CAR-T细胞杀伤癌细胞不需要借助抗原递呈，而大大提高癌细胞杀伤效率。2012年美国宾夕法尼亚大学Carl June教授使用靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T细胞治愈白血病患儿EmilyWhitehead，2017年美国FDA又突破性批准两款CAR-T细胞药物用于B细胞白血病和淋巴瘤治疗，成为细胞治疗领域的一个里程碑。

与传统自体免疫细胞疗法相比CAR-T细胞有诸多优势：(一)靶向性：通过肿瘤抗原特异性单链抗体或配体识别，使CAR-T细胞可以特异性靶向肿瘤细胞；(二)杀伤效率高：2018年Nature报道个例中来源于1个TET2缺失的CAR-T细胞杀死全部肿瘤细胞，治愈白血病；(三)抗原识别范围广：CAR-T细胞能发现所有被抗体识别的肿瘤抗原，包括蛋白抗原、糖类抗原和脂类抗原等；(四)无MHC限制性：CAR-T细胞通过武装的scFv直接识别肿瘤细胞，可以克服肿瘤下调MHC-I分子而发生的免疫逃逸。

针对血液系统肿瘤，CAR-T细胞治疗已取得巨大成就，目前，美国FDA已经先后批准了诺华和吉利德公司的CAR-T细胞产品上市，用于治疗急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，定价分别为47.5万美元(约合300万人民币)和37.3万美元(约合250万人民币)。截至目前，在ClinicalTrials网站注册CAR-T细胞治疗肿瘤临床试验407项，其中针对血液系统肿瘤276项，针对实体瘤131项。在我国，国家药品监督管理局已经受理26项CAR-T细胞治疗肿瘤药物临床申请，仅有1种靶向实体瘤(GPC3)，目前，已有传奇生物、恒润达生、科济生物等公司8项获得药物临床试验批件，标示着国内CAR-T细胞治疗规范化时代已经来临。

目前，靶向CD19、CD22、BCMA的CAR-T细胞治疗血液系统肿瘤已取得长足进步，疗效显著，但针对实体肿瘤的CAR-T细胞治疗进展缓慢，缺乏安全有效的特异性肿瘤抗原靶点是重要的阻滞因素之一。

B7H3又称CD276，属于B7免疫检查点超家族，是一种I型跨膜蛋白，由包含两对相同免疫球蛋白可变区和恒定区的胞外区和较短的胞内区构成。其mRNA表达较为广泛，但蛋白表达非常局限。诸多研究揭示B7H3在多种肿瘤中高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等，其表达水平与患者预后不良密切相关。因此，本发明人选用作为靶点，制备的CAR-T细胞靶向广谱实体肿瘤，可应用范围广。而靶向B7H3的抗体药物、抗体-药物偶联物、放射材料标记抗体、CD3-B7H3双特异性抗体等药物已开展多项针对腹膜癌、神经胶质瘤以及中枢神经肿瘤等肿瘤的I、II期临床试验，显示令人鼓舞的初步结果，未出现不良事件，表明靶向B7H3的疗法是安全可靠的。

发明内容