[发明专利]一种纳豆激酶的制备方法

权利要求书

1.一种纳豆激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液；

将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液；

用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液；

将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。

2.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤中，

所述离心时，转速为8000～12000r/min，离心时间为10～15min；

所述过滤时，采用砂滤棒过滤。

3.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液的步骤中，包括：

将所述粗酶液通过陶瓷膜过滤，得一级透过液；

将所述一级透过液通过一级超滤膜过滤，得二级透过液；

将所述二级透过液通过二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；

将所述一级浓缩液通过纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。

4.如权利要求3所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述陶瓷膜截留的分子量为90～100KDa；所述一级超滤膜截留的分子量为45～50KDa；所述一级超滤膜截留的分子量为15～10KDa；所述纳滤膜截留的分子量为1～5KDa。

5.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液的步骤中，所述超滤法精细提纯包括：

将所述洗脱液通过截留分子量为1～5KDa的超滤膜浓缩，收集浓缩液。

6.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品的步骤中，所述真空低温微波干燥的温度为30～40℃，干燥时间为24～48h。

7.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤之前，还包括以下步骤：

从纳豆制品或纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，测定所述菌液的产酶能力，并挑选出最大酶活的菌株作为出发菌株；

将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落；

挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的种子液；

将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液。

8.如权利要求7所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落的步骤中，

所述斜面培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L，NaCl 9～10g/L以及琼脂粉1.5～1.8％；和/或，

所述培养的时间为22～24h。

9.如权利要求7所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的菌液的步骤，包括：

挑取单菌落接种于液体种子培养基中，于25～40℃温度下培养12～16h，得种子液；

将所述种子液按体积比0.5％～1％接种于所述液体种子培养基中，于25～40℃温度下继续培养12～16h，得扩大培养的种子液；

其中，所述液体种子培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L以及NaCl 9～10g/L，且所述液体种子培养基pH为7.0～8.0；和/或，

所述培养时的转速为150～500r/min。

10.如权利要求7所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液的步骤，包括：

将所述扩大培养的种子液按体积比0.5％～5％接种于发酵培养基中，于25～40℃温度下培养24～72h，得纳豆菌发酵液；

其中，所述发酵培养基包括：蔗糖18～30g/L，黄豆粉9～15g/L，甘油0～6g/L，KH₂PO₄1.5～3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 10～18g/L，CaCl₂ 0～0.5g/L以及MgSO₄ 0～0.5g/L。