[发明专利]一种RAA荧光法检测隐孢子虫的引物、探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测隐孢子虫的引物、探针及检测方法，本发明的方法能方便快速准确地鉴定隐孢子虫，操作简便，检测时间短，15min内完成检测；本发明的检测方法快速、容易实现高通量，检测成本大大降低；且灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为100Copies/反应；样本验证可以检测到1个隐孢子虫卵囊。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及一种RAA荧光法检测隐孢子虫的引物、探针及检测方法。

背景技术

隐孢子虫是一类常见的寄生于人和动物体内的顶复门寄生原虫，为人畜共患寄生虫病，可通过污染水源、食物、接触动物等多种途径而受到感染，可感染包括人在内的170余种脊椎动物，以感染性的卵囊形式随寄主粪便排出体外，人或动物摄入受隐孢子虫卵囊污染的水或食物而感染隐孢子虫病，表现为反胃、腹泻和痉挛等。处于感染阶段的卵囊在水环境中为生物学上的潜伏期，它不进行自我复制及增殖，能抵抗饮用水常用消毒剂，在水和土壤中可存活数月，在4℃水中甚至可存活1年之久。隐孢子虫卵囊直径4～6μm，致病剂量为10个活卵囊。隐孢子虫病呈世界性分布，迄今已有74个国家、至少300个地区有报道，各地感染率高低不一，一般发达国家或地区感染率低于发展中国家或地区。在腹泻患者中，欧洲、北美洲隐孢子虫检出率为0.6％～20％，亚洲、大洋洲、非洲和中南美洲检出率为3％～32％。大量研究表明，隐孢子虫的发病率与当地的空肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和蓝氏贾第鞭毛虫相近，在寄生虫性腹泻中占首位。我国于1987年在南京市区首次发现了人体感染隐孢子虫病的病例，之后在江苏、重庆、安徽、内蒙、福建、山东和湖南都曾有相关病例的报道。

隐孢子虫广泛寄居在大自然的各类水体中，其卵囊可以长期存在于水体中，人一旦饮用被隐孢子虫卵囊污染的水，就极有可能发病。隐孢子虫主要来自于养殖场、农场和屠宰场，通过排放的受污染水，来对其他水环境造成污染。通过优化水处理工艺可以起到一定的去除效果，但由于其对传统的氯消毒剂有较强的抗性，在水环境中存活时间长，因此并不能将其完全消除。只有加强实时监测，根据监测结果采取针对性的措施，才能有效降低隐孢子虫的危害。

目前对隐孢子虫的检测方法主要为三种，分别为病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测。其中，诊断的“金标准”为病原学检测方法，通过显微镜下检测粪便中的卵囊，来对隐孢子虫进行确诊，但该方法具有费时费力，敏感性、特异性均不高，且不能辨别虫种和基因型的缺点。而分子生物学检测技术主要是实时荧光定量PCR技术，其原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。这种方法灵敏、特异、检出率高，但对人员要求及设备要求高，检测时间为1.5～2小时。此外，水源常用的隐孢子虫检测方法为USEPA1623法。该方法的主要步骤为过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、荧光显色和镜检，该方法的主要缺点是需要的水样体积较大，并且操作非常复杂，步骤多，操作要求很高，镜检时误差也较大，容易漏检产生假阴性，定种溯源效果不理想，完成整个检测需要2-3天时间。此外，如果采用此种方法，每个样品的检测成本很高。

鉴于现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阴性高等缺点，提供一种RAA荧光法检测隐孢子虫的引物、探针及检测方法，使其快速、灵敏、操作简便、适用于实验室及现场快速检测，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测隐孢子虫的引物、探针及检测方法，能在39℃条件下5-15min完成隐孢子虫的检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于实验室及现场快速检测的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种RAA荧光法检测隐孢子虫的引物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-CWATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3’；SEQ ID NO.4；

下游引物：5’-CTCCAATTGATACTYGTWAAGGGGTTTATAC-3’；SEQ ID NO.5。