[发明专利]一种毛囊EMIs微环境模型的构建方法

权利要求书

1.一种毛囊EMIs微环境模型的构建方法，其特征在于，所述的毛囊EMIs微环境模型的构建方法，具体包括以下步骤：

步骤一：毛囊种子细胞的分离和获取：采用显微解剖结合酶消化后再离心过滤的方法以高效分离毛乳头并获得人毛乳头细胞；同时采用精细显微分离结合酶消化的技术方法获得高纯度的人毛囊干细胞；

步骤二：毛囊EMIs微环境模型的构建：采用微阵列三维悬滴培养平台的基础上，将hDPCs微组织、hFSCs以不同组合方式构建，并从共培养条件上进一步优化筛选出最佳的毛囊EMIs微环境模；

步骤三：毛囊EMIs微环境模型的体外生物学验证：通过形态学、组织学、细胞生物学、细胞空间排列分布、毛发诱导和毛干分化表型、上皮-间质细胞相互作用信号通路机制进行体外的生物学验证和系统评价；

步骤四：毛囊EMIs微环境模型的体内生物学验证：通过显微操作将其移植于裸鼠进行体内诱导重建，移植后从毛囊组织学、毛干特性及成分、毛囊周期、毛囊内细胞排列分布进行体内的生物学验证和系统评价。

2.如权利要求1所述的毛囊EMIs微环境模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，hDPCs的分离和培养：

(1)取行面部除皱、毛发移植或头皮软组织扩张术患者术中多余的头皮毛囊组织标本；

(2)采用显微解剖结合酶消化过滤的方法进行人头皮毛囊毛乳头组织的分离；

(3)将获取的人毛乳头采用常规的二维原代培养进行短期的体外扩增获得人毛乳头细胞。

3.如权利要求1所述的毛囊EMIs微环境模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，hFSCs的分离和培养：

(1)取面部除皱、毛发移植或头皮软组织扩张术患者术中多余的头皮毛囊组织样本；

(2)采用显微分离结合酶纯化的方法挑选毛囊上皮隆突区组织进行人毛囊上皮来源干细胞的原代培养；

(3)对获得的细胞进行常规的体外扩增和细胞鉴定。

4.如权利要求1所述的毛囊EMIs微环境模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，人毛囊EMIs微环境模型的构建：96孔微阵列三维悬滴培养平台，以高通量的培养方式构建不同组合类型的仿生三维共培养体系：

(1)模型1：将hDPCs与hFSCs按一定比例预混合后接种至悬滴板内进行三维共培养，培养一定时间，形成“单纯混合型”仿生微组织混合体(hDPCs-hFSCs Mixed microtissues)，见技术路线中模型1；

(2)模型2：分别将hDPCs和hFSCs通过三维悬滴培养同时构建成仿生微组织，然后按一定比例接种至悬滴板内以均匀混合两种微组织，共培养一定时间，形成“紧密接触型”仿生微组织混合体，见技术路线中模型2；

(3)模型3：先将hDPCs通过三维悬滴培养构建成仿生微组织后，再加入一定比例的hFSCs，共培养一定时间，形成内层为hDPCs仿生微组织、外层为hFSCs包裹的“核心包绕型”仿生微组织混合体，见技术路线中模型3；

(4)模型的优化：主要从以下几个方面对培养条件进行优化和筛选：

①hDPCs与hFSCs的接种数量：将hDPCs和hFSCs的接种密度设置为0.25×104/孔、0.5×104/孔、1×104/孔、2×104/孔；

②hDPCs与hFSCs接种的相互比例：根据细胞接种的数量，将hDPCs与hFSCs接种数量间的相互比例设置为1:1、1:2、1:4分别进行共培养；

③混合培养基的相互配比：将间充质干细胞培养基与上皮细胞培养基(K-SFM)通过1:1、1:2、1:4的不同配比制成混合条件培养基，将共培养的换液时间设置为每天或每2天换液1次；

综合以上几方面指标，筛选出最适宜的共培养条件和模型，进行后续的体外检测及体内动物实验。