[发明专利]分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗李痘病毒(Plum pox virus，PPV)单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。利用原核表达的李痘病毒的外壳蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗PPV单抗的杂交瘤细胞株4A8，其保藏号为CGMCC No.17283。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa轻链，该单抗与PPV的外壳蛋白亚基有特异反应。利用4A8单抗建立了检测梅树中PPV的TAS‑ELISA、dot‑ELISA检测方法，其中TAS‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:20480和1:5120倍稀释(w/v,g/mL)。抗PPV单抗的制备及其检测方法的建立为果园李痘病毒病的诊断和检测、进出口岸检验检疫及科学防控提供物质和技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

李痘病毒病最先于1915年在保加利亚被发现，之后蔓延至整个欧美地区，给发病地区核果类果树造成严重危害。病原李痘病毒(Plum pox virus,PPV)由Atanasoff在李树上发现以来，现已分布于欧洲、在非洲、北美洲、南美洲、亚洲。自从2001年起，我国先后在湖南、南京、西安发现李痘病毒，我国农业农村部高度重视，将李痘病毒列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

PPV是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒，能侵染多种木本科和草本科寄主。木本寄主主要包括具有经济重要性的桃、李、杏和樱桃等，草本寄主主要包括菊叶香藜、宝盖草、苋色藜等。寄主果树被侵染后各个部位均可表现明显症状：叶片出现褪绿环斑、叶脉黄化、扭曲畸形；花出现斑驳、畸形；果实出现斑驳、变形变小，大量果实提前脱落。PPV传播速度快，在短时间内即可给核果类果树带来毁灭性危害，引起灾难性的经济损失。PPV病毒粒子为弯曲杆状，长约660-770nm，宽约12-15nm。PPV基因组是一条大小9741–9795nt的正义单链RNA，基因组只有一个ORF，翻译产生一个360kDa大小的多聚蛋白，裂解成至少十个功能蛋白，分别是P1，HCPro，P3，6K1，CI，6K2，VPg，NIapro，NIb和CP。

为了调查我国核果类果树上PPV的发病情况、强化我国李痘病毒病检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测PPV快速、经济、准确、高通量的检测技术。与常规的指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点，是植物病毒检测和调查最常用的方法。目前已有关于PPV抗体制备和血清学方法的报道，但已报道的PPV抗体和血清学方法的检测灵敏度欠佳，准确率不高。为此，本发明以重组的PPV衣壳蛋白(CP)作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗PPV的特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PPV的高通量的血清学方法，从而为我国李痘病毒的检测和诊断、进出口岸检验检疫、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株4A8，它能分泌抗李痘病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株4A8于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17283。

一种所述的杂交瘤细胞分泌抗李痘病毒单克隆抗体，抗李痘病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与李痘病毒36kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用TAS-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测PPV感染病叶粗提液的灵敏度达到1:20480和1:5120倍稀释。