[发明专利]分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。柑橘黄龙病叶脉粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9，其保藏号为CGMCC No.17285。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与病叶中56kDa的黄龙病菌蛋白有特异反应，与健康树叶不发生免疫反应。利用11H9单抗建立检测柑橘黄龙病菌的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue blot‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测黄龙病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗柑橘黄龙病菌单抗的制备及其检测方法的建立为柑橘黄龙病的诊断和检测、流行病学分析、无菌苗木生产及科学防控提供物质和技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗柑橘黄龙病菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

20世纪初，柑橘黄龙病已经相继在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50多个国家和地区爆发。我国于1919年在华南地区首次报导了柑橘黄龙病，目前该病陆续在我国广东、江西、海南、广西、福建、浙江、云南、贵州、湖南、重庆等省(自治区或直辖市)发生流行，我国柑橘栽培区均遭受柑橘黄龙病危害，受灾面积已达总面积的80％，产量损失85％。柑橘产业因为黄龙病的大范围爆发而面临着前所未有的危机。柑橘黄龙病是由原核生物薄壁菌门韧皮部杆菌属细菌(Candidatus Liberibacter sp.)在柑橘等芸香科果树上引起的系统性、毁灭性病害。在不同的地区和国家曾有不同的名称，如黄枯病、青果病、黄梢病等。柑橘黄龙病的病原属于革兰氏阴性细菌，寄生于筛管细胞，属于植物内生细菌，菌体大小约为350-550nm×600-1500nm,可通过筛孔进行移动，病原具两层外膜,厚约20-25nm。柑橘黄龙病的传播有3种方式，分别是昆虫木虱传播、嫁接传播和苗木交易，其中嫁接传播和病苗的交易是柑橘黄龙病远距离传播的主要途径，染病接穗和病苗是主要载体。昆虫传播媒介有亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)和非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)。

目前，对柑橘黄龙病菌的检测和诊断多采用低效率的症状观察、指示植物、电镜观察、PCR等方法进行检测，还没有快速实用、高通量的检测技术和方法。本发明以柑橘黄龙病叶脉粗提液作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株能分泌抗柑橘黄龙病菌特异性单抗的杂交瘤细胞株，并以分泌的单抗为核心建立检测柑橘黄龙病菌的快速实用、准确、高通量的血清学方法，从而为柑橘黄龙病菌的检测和诊断、流行病学的调查、无菌苗木的获得及科学防控体系的建立提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株11H9，它能分泌抗柑橘黄龙病菌的特异性单抗，杂交瘤细胞株11H9于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17285。

一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗柑橘黄龙病菌单抗，抗柑橘黄龙病菌单抗腹水间接ELISA效价达10-⁷，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与柑橘黄龙病病叶中56Kda的黄龙病菌蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测黄龙病病叶粗提液的灵敏度分别达到1:20480和1:10240倍稀释。

抗柑橘黄龙病菌单抗能与来自中国各个地方的感染柑橘黄龙病病叶粗提液有特异性反应，而不与健康的树叶粗提液反应。

抗柑橘黄龙病菌单抗在该病害检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。