[发明专利]基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的制备

a.氨基化还原氧化石墨烯的预处理

取2～20mg氨基化还原氧化石墨烯加入到10～100mL的无水乙醇中，超声分散5～10h，制备成浓度为0.02～2mg/mL的rGO-NH₂乙醇分散液；

b.AuNPs溶液合成

将50～100mL去离子水和1～10mL 0.01～0.1moL/L HAuCl₄·4H₂O溶液加入到烧杯中，然后磁力搅拌下，加热至沸腾，在沸腾状态下，迅速加入0.1～10mL的0.01～0.1moL/L柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，沸腾状态下继续加热搅拌10～60min，即得AuNPs溶液；

c.rGO-NH₂@AuNPs材料合成

取1～10mL浓度为0.02～2mg/mL的rGO-NH₂乙醇分散液，加入到10～50mL AuNPs溶液中，室温搅拌6～24h，3000～6000rpm条件下离心清洗三次，保留沉淀，将沉淀加入无水乙醇，获得0.02～2mg/mL的rGO-NH₂@AuNPs溶液；

d.0.01～0.1moL/L氨基二茂铁溶液制备

取0.004～0.04g氨基二茂铁固体溶于0.2～2mL无水乙醇中，超声10～50min，使氨基二茂铁完全溶于无水乙醇，即得0.01～0.1moL/L氨基二茂铁溶液；

e.rGO-NH₂@AuNPsFc分散液制备

取10～50mL 0.02～2mg/mL的rGO-NH₂@AuNPs溶液于烧杯中，向溶液中加入1～10mL 5～25wt％戊二醛溶液，在室温下磁力搅拌反应1～3h，3000～6000rpm条件下无水乙醇离心清洗三次，取下层沉淀分散于10～50mL无水乙醇中，向其中加入0.1～1mL 0.01～0.1moL/L氨基二茂铁溶液，室温条件下磁力搅拌反应3～6h，3000～6000rpm条件下去离子水离心清洗三次，取下层沉淀分散于去离子水中，制备成浓度为0.02～2mg/mL的rGO-NH₂@AuNPsFc分散液；

f.功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料制备

取10～50μL含1～10μmol/L Probe DNA1、1～10μmol/L Probe DNA2和1～10mmol/L三(2-羧乙基)膦的pH＝7～8的0.01～0.1mol/L的PBS缓冲液，加入10～50μL浓度为0.02～2mg/mL的rGO-NH₂@AuNPsFc分散液，在4℃孵育6～12h，离心清洗三次，分散于10～50μL的去离子水中，即得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；

(2)固载有Probe DNA3金电极的制备

a.将直径为2mm的金电极依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃抛光成镜面，然后依次用由浓硝酸和水按体积比为1：1混合而成的硝酸溶液、无水乙醇、水超声洗涤1～5min，水冲洗干净后，氮气吹干备用；

b.取5～10μL含Probe DNA3和三(2-羧乙基)膦的PBS缓冲溶液，滴在金电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置20～40min；所述的含Probe DNA3和三(2-羧乙基)膦的PBS缓冲溶液中Probe DNA3的浓度为1～10μmol/L以及三(2-羧乙基)膦的浓度为1～10mmol/L，溶剂为pH＝7～8的0.01～0.1mol/L的PBS缓冲液；

c.将步骤(2)b所得的Probe DNA3修饰电极用pH＝7～8的0.01～0.1mol/L的PBS缓冲液淋洗；

d.取5～10μL 1～5mmol/L的3-巯基-1-丙醇滴加到步骤(2)c处理后的电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置0.5～1h，即得固载有Probe DNA3金电极；(3)Hg²⁺电化学生物传感器的构建

取3～5μL含Hg²⁺的溶液加入到3～5μL功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀；取5μL混合均匀的溶液滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1h后，用pH＝7～8的0.01～0.1mol/L的PBS缓冲液清洗电极，即制备得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器，其中所述的Probe DNA1结构式为：5′

-TTCTTGTATAGCATCTGCA-(CH₂)₃-SH-3′；所述的Probe DNA2结构式为：5′-TGCAGATGCT-3′；所述的Probe DNA3结构式为：5′-TTACTAGTT-(CH₂)₃-SH-3′。

2.一种利用权利要求1制备的基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器用于汞离子检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

以制备得到的捕获Hg²⁺后结合有功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的金电极为工作电极，铂电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，置入0.1～1mol/L高氯酸钠溶液，采用快速扫描循环伏安法，初始电位为-0.5～0V，终止电位为0.3～0.8V，电位扫描速度为100～600V/s；测定不同浓度Hg²⁺条件下对应的氧化峰值电流，建立Hg²⁺浓度与峰电流的定量关系，根据该定量关系测定未知样品中Hg²⁺的浓度。