[发明专利]一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法

权利要求书

1.一种表达芳香族异戊烯基转移酶的方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：根据NCBI中查找到的MBP的序列，去掉终止密码子，在两端引入NcoI和HindIII两个酶切位点，设计得到引物，然后进行PCR扩增得到第一MBP片段；

步骤2：根据NCBI中查找到的MBP的序列，保留终止密码子，在两端引入NdeI和KpnI两个酶切位点，设计得到引物，然后进行PCR扩增得到第二MBP片段；

步骤3：使用限制性内切酶切割第一MBP片段和质粒pET28a，清洁回收后利用T4连接酶将第一MBP片段和质粒pET28a连接起来，得到载体pET28a-MBP；使用限制性内切酶切割第二MBP片段和质粒pETDuet-1，清洁回收后利用T4连接酶将第二MBP片段和质粒pETDuet-1连接起来，得到载体pETDuet-1-MBP；

步骤4：以链霉菌总DNA为模板，使用引物F3和R3进行PCR扩增，经PCR纯化试剂盒纯化后得到片段3；以链霉菌总DNA为模板，使用引物F4和R4进行PCR扩增，经PCR纯化试剂盒纯化后得到片段4；

F3:5’CCCAAGCTTGAGAATCTTTATTTCCAAGGTTCTATGCCCGCACTCCCGATGAAT-3’；

R3:5’ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCGGGCACCTCCGGTGATC-3’；

F4:5’ -CATGCCATGGATGCCCGCACTCCCGATGAAT-3’；

R4:5’- CCCAAGCTTTCATCGGGCACCTCCGGTGATC-3’；

步骤5：使用限制性内切酶切割片段3和载体pET28a-MBP，清洁回收后利用T4连接酶将片段3和载体pET28a-MBP连接起来，得到芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pET28a-MBP-NovQ；使用限制性内切酶切割片段4和载体pETDuet-1-MBP，清洁回收后利用T4连接酶将片段4和载体pETDuet-1-MBP连接起来，得到芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pETDuet-1-MBP-NovQ；

步骤6：将芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pET28a-MBP-NovQ转化入大肠杆菌DH5α中，扩增获取表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到可溶性芳香族异戊烯基转移酶表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ，将芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pETDuet-1-MBP-NovQ导入大肠杆菌DH5α中，扩增获取表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到第二种可溶性芳香族异戊烯基转移酶表达菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)- pETDuet-1-MBP-NovQ；

步骤7：将大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ单菌落，接种于LB液体培养基，培养得到活化后的大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌液；吸取活化后的大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌液接种于新的LB液体培养基中，培养至菌液OD值为0.6-0.8，得到大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ诱导前菌液；向所述大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ诱导前菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，振荡培养3-4h后对发酵液离心除去培养基，得到大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌体；向所述BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌体中加入PBS缓冲液，重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，得到的破碎液离心20min弃沉淀，得到的上清液即为含有MBP-NovQ融合蛋白的溶液；使用直链淀粉柱纯化含有MBP-NovQ融合蛋白的溶液，即得MBP-NovQ纯酶溶液；

步骤8：将大肠杆菌Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ单菌落，接种于LB液体培养基，培养得到活化后的大肠杆菌Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ菌液；吸取活化后的大肠杆菌Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ菌液接种于新的LB液体培养基中，培养至菌液OD值为0.6-0.8，得到大肠杆菌Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ诱导前菌液；向所述大肠杆菌Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ诱导前菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，振荡培养3-4h后对发酵液离心除去培养基，得到大肠杆菌Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ菌体；向所述Rosetta(DE3)-pETDuet-1-MBP-NovQ菌体中加入PBS缓冲液，重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，得到的破碎液离心弃沉淀，得到的上清液即为含有可溶性NovQ蛋白的溶液；使用Ni-NT resin纯化含有NovQ蛋白的溶液，即得NovQ纯酶溶液；

步骤9：将大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ单菌落，接种于LB液体培养基，培养得到活化后的大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌液；吸取活化后的大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌液接种于新的LB液体培养基中，培养至菌液OD值为0.6-0.8，得到大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ诱导前菌液；向所述大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ诱导前菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，振荡培养3-4h后对发酵液离心除去培养基，得到大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌体；向所述BL21(DE3)-pET28a-MBP-NovQ菌体中加入PBS缓冲液，重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，得到的破碎液离心20min弃沉淀，得到的上清液即为含有MBP-NovQ融合蛋白的溶液；使用直链淀粉柱纯化含有MBP-NovQ融合蛋白的溶液，且在纯化过程中加入TEV蛋白酶，得到酶切过的NovQ纯酶溶液。