[发明专利]一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法

权利要求书

1.一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、古DNA的提取

步骤二、古DNA的定量

选择人类线粒体DNA序列，设计一段113bp长的DNA片段，并设计好探针，同时合成引物和序列如下：

L15997 CACCATTAGCACCCAAAGCT

H16071 ACATAGCGGTTGTTGATGGG

Probe-113 VIC-GAAGCAGATTTGGGTAC

制备标准品包括：PCR扩增目标片段，PCR产物的纯化，重组质粒的转染，菌落PCR，菌落PCR成功的细菌进行恒温培养，摇菌过夜，质粒的提取，保准品制备完成；

用实时荧光定量PCR SYBR方法对标准品和古DNA样品进行扩增，根据标准品的扩增结果，绘制标准曲线，进而计算古DNA样品绝对定量结果；

步骤三、性别位点A引物的合成

Amelogenin基因通常在X和Y染色体上分布的片段长度不同，电泳后出现106bp和112bp两条带的是男性，只出现106bp一条带的是女性，合成引物和序列如下：

步骤四、性别位点B引物的合成

用3个特异性性别引物分别对样本X和Y染色体片段进行扩增，引物M4作用于X和Y染色体5'端；引物M5只作用于X染色体3'端；而M6仅作用于Y染色体3'端；

X染色体扩增产物片段大小为330bp；Y染色体扩增产物片段大小为218bp，引物M4、M5和M6序列如下：

步骤五、两对性别位点的结合：分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，将性别位点A和B进行整合，作为古代人类遗骸性别鉴定的Markers；

步骤六、性别位点A和B的扩增和鉴定

合成MGB探针，用实时荧光定量PCR探针法，使用NEB Luna Universal Probe QpcrMaster Mix，M3004，同时对性别位点A和B进行扩增，将性别位点A和B的扩增结果放在一起综合分析，最后得到古人类遗骸个体性别信息。

2.根据权利要求1所述的一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，

步骤一所述的古DNA的提取，具体为：

(1)称取0.5～2g骨粉，加入1ml的10％SDS；4ml的pH 8.0的EDTA和100μl的10mg/ml蛋白酶K，于37℃震荡过夜；过夜后的DNA提取样品转入空气浴中震荡，于55℃继续震荡温浴6h，然后于95℃放置5min，使多余的蛋白酶K失活；

(2)将步骤(1)产物7500r/min离心8min后，取800μl上清液加入到超滤离心管中，6800r/min离心，将裂解液浓缩到100μl；

(3)加入300μl结合缓冲液和20μl的磁珠悬浮液颠倒混匀10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠吸附到侧壁，吸走离心管内液体，所述的结合缓冲液为5M GuSCN，25mM NaCl和50mM Tris的混合物；

(4)加入500μl洗涤缓冲液轻柔颠倒数次，利用磁力架吸附磁珠，1min后吸走管内液体，洗涤过程重复一次，洗涤缓冲液为125mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0的1mM EDTA以及占总体积50％的乙醇；

(5)取下离心管，加入50～100μl的TE洗脱液，使磁珠悬浮，55℃水浴10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将洗脱液转移至干净的离心管中，得到古DNA提取溶液；TE洗脱液为10mM Tris和pH 8.0的1mM EDTA混合物。

3.根据权利要求1所述的一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，步骤二所述的计算古DNA样品绝对定量结果，具体为：

用NEB公司的Luna Universal qPCR Master Mix，M3003做实时荧光定量PCR，标准品每个重复三次，模板上样量0.5μl，总体系20μl；qPCR扩增反应条件：95℃60s；95℃15s，60℃30s，40个循环。

4.根据权利要求1所述的一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤六具体为：

PCR体系：Probe qPCR mix 10ul，20uM正向引物0.5μl，20uM的反向引物0.5μl，10uM的Probe-AMGX0.4μl，10uM的Probe-AMGY 0.4μl，模板DNA 0.5μl，加水让总体积达到20μl；

PCR扩增反应条件：95℃60s；95℃15s，60℃30s，40个循环；

利用上述反应体系和反应条件，借助96孔板在实时荧光定量PCR仪上运行，综合分析得到性别位点扩增结果，根据扩增结果获得样本的性别信息。