[发明专利]一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法

权利要求书

1.一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、无菌不定芽的获得：切取兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到不定芽诱导培养基中，然后加入头孢呋辛钠溶液覆盖培养基表面，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，获得不定芽，所述的不定芽诱导培养基为：每升含有椰子乳20-50mL、BA 5-10 mg、蔗糖15-20 g、NaH₂PO₄ 0.17-0.34 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/4-1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；

b、叶丛芽诱导与增殖：纵切不定芽的生长点，接种至叶丛芽诱导培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，直至不定芽增殖分化成叶丛芽；将叶丛芽切下来，纵切其生长点，接种至叶丛芽增殖培养基中进行叶丛芽增殖培养，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，叶丛芽增殖培养继代周期为60天，每次培养均将上一次培养获得的叶丛芽切割，同时纵切叶丛芽的生长点；所述的叶丛芽诱导培养基为：每升含有椰子乳150-200 mL、TDZ 0.75-1.5 mg、蔗糖20-30 g、NaH₂PO₄ 0.17-0.34g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/2-1MS培养基，pH 5.8-6.0；所述的叶丛芽增殖培养基为：每升含有椰子乳150-200 mL、TDZ 0.25-0.7 mg、蔗糖20-30 g、NaH₂PO₄ 0.17-0.34 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/2-1MS培养基，pH 5.8-6.0；

c、叶丛芽恢复成正常的不定芽：将叶丛芽增殖培养获得的叶丛芽切割，同时纵切叶丛芽的生长点，接种至叶丛芽恢复常芽培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，叶丛芽增殖分化出不定芽；所述的叶丛芽恢复常芽培养基为：每升含有椰子乳25-50 mL、蔗糖10-20 g、NaH₂PO₄ 0.17-0.34 g、蛋白胨2-4 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/4-1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；

d、不定芽的生根壮苗培养：将不定芽从成团不定芽中分离出来接种至生根壮苗培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，获得生根的组培苗；所述的生根壮苗培养基为：每升含有椰子乳50-75 mL、蔗糖15-25 g、NaH₂PO₄ 0.17-0.34 g、NAA 0.5-1 mg、活性炭0.3-0.5 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为改良MS培养基，pH 5.8-6.0；所述的改良MS培养基是将MS培养基中的NH₄NO₃和KNO₃改变为原来的1.5-2倍，其余成份不变；

e、组培苗的移栽：将组培苗移入栽培基质中培养获得兜兰种苗，所述的栽培基质为植金石、树皮和椰壳按体积比为1-3:1-3:1混合的混合基质。

2.根据权利要求1所述的通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的切取兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到不定芽诱导培养基中具体为：在切取外植体前14 d用80-100 mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，间隔7天后再用80-100 mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，切取侧芽，然后在超净工作台上将切下的侧芽先用体积分数75%-80%的酒精水溶液浸泡30-60秒，切掉叶片，再用体积分数75%-80%的酒精水溶液浸泡30-60秒，无菌水冲洗3-5次，再用质量分数0.1%-0.2%的升汞水溶液消毒5-10分钟，无菌水冲洗4-5次，接种到不定芽诱导培养基中。

3.根据权利要求1所述的通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的头孢呋辛钠溶液为质量分数为11%-20%的头孢呋辛钠溶液。