[发明专利]一种基因重组人促皮质素与白蛋白的融合蛋白及表达方法

说明书

人促皮质素又称促肾上腺皮质激素（ACTH），目前是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药。人血清白蛋白（ALB）在体内具有稳定其它蛋白质的作用。本发明通过基因工程技术，优化设计并构建基因重组ACTH与ALB的融合蛋白表达质粒，并在BL21‑DE3菌株中表达。ACTH与ALB通过组织型纤溶酶原激活剂的底物识别序列（tPAst）相连接起，tPAst在体内可以被组织型纤溶酶原激活剂识别并水解，从而可以逐渐释放出游离的ACTH与ALB。

技术领域

本发明属于基因工程制药，涉及一种利用微生物表达的基因重组融合蛋白及其DNA和蛋白质序列，以及该融合蛋白的表达方法。

背景技术

促皮质素(Corticotropin)也称促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropichormone，ACTH)，是由垂体的前叶、下丘脑、肾上腺髓质、肠道和胎盘等组织分泌的一种39个氨基酸的多肽类激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢，调节心脑血管功能、提高抵抗力，调控糖皮质激素(GC)的合成与分泌，神经损伤恢复与再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药，该病发病率0.5％～1％，6～33％的婴儿惊厥症患儿在3岁前死亡，70～90％患儿智力发育缓慢，30％发展为自闭症。ACTH也用于红斑狼疮、多发性硬化病急性恶化、肾病综合征、全身性皮肌炎和结节病的治疗；还用于银屑病关节炎、风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及严重眼部过敏和炎症等的辅助治疗。目前医药市场上流通的注射用人促肾上腺皮质激素(简称促皮质素，ACTH)主要有两个来源：一是在动物脏器中提取，生产成本高并且有传播动物病毒和支原体的潜在风险。二是由人工合成具有生物活性的ACTH前24肽，其工艺复杂、成本高、产量小、半衰期较短,并且化学合成的方法不易控制其产物旋光性。ACTH在血液中容易被蛋白酶降解，血浆半衰期很短。本发明从工程菌中表达制备基因重组ACTH融合蛋白，生产成本低，基本不会传播动物病毒和支原体。

人血清白蛋白(ALB)是人体血液中含量最多的蛋白质，含有585个氨基酸，具有结合其它化合物、维持血液渗透压、抗凝血、清除自由基、增强人免疫力和抵抗力等作用，其在体内的半衰期较长，约为19天。ALB制剂在临床上广泛用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等。人血清白蛋白可以保护与其结合的蛋白质不被血浆中的各种蛋白酶降解，从而延长蛋白质在血浆中的半衰期。

组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是血液中的一种蛋白酶，它可以特异性识别底物蛋白质当中的酶切识别位点序列“CPGRVVGG”(简称为tPAst)，并在该位点处将底物蛋白质切割成两段。在本发明表达的融合蛋白中，以tPAst连接ACTH与ALB，形成融合蛋白结构ACTH-tPAst-ALB，当融合蛋白被注射入血液后，血液中tPA的作用下，ACTH-tPAst-ALB融合蛋白会逐渐释放出游离的ACTH及ALB蛋白。

构建的表达ACTH与ALB的融合蛋白的表达质粒在本专利中称为ACTH-tPAst-ALB-pET21a。其中tPAst为如上所述组织型纤溶酶原激活剂底物序列(氨基酸序列为CPGRVVGG)。

发明内容

1.发明的目的

利用工程菌表达及制备一种基因重组融合蛋白(ACTH-tPAst-ALB)的方法，ACTH与ALB通过tPAst氨基酸序列相连，tPAst在血液中可以被蛋白酶tPA识别并切割成两段。

2.发明的技术方案

一、使用设计的引物以及重叠PCR技术将编码ACTH、tPAst和ALB的核苷酸序列相连，构建两端带有内切酶位点(BamHI和SalI)的cDNA架构：BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI。

二、双酶切BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及空白载体pET21a，产生互补的粘性末端。