[发明专利]用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910187563.9 | 申请日： | 2019-03-13 |
| 公开（公告）号： | CN109999188A | 公开（公告）日： | 2019-07-12 |
| 发明（设计）人： | 王金磊;杨文彬;侯俊玲;梁勤立;陈凯;周东辉;朱兴全 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | A61K39/002 | 分类号： | A61K39/002;A61P33/02;C12N15/90;C12N15/79;C12N15/30 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 弓形虫感染 减毒活疫苗 弓形虫 制备 制备方法和应用 免疫保护作用 免疫接种程序 细胞培养基 动物实验 弓形虫病 构建质粒 抗性片段 免疫保护 毒虫 混悬液 溶剂 构建 预防 应用 | ||
1.一种用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗，其特征在于，所述减毒活疫苗是以PBS作为溶剂制成的弓形虫弱毒虫株RH:ΔNPT1的速殖子混悬液。
2.如权利要求1所述的用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)敲除质粒的构建
根据弓形虫NPT1基因设计sgRNA：GATGAAGGTGCAAGCTCCCG，然后将pSAG1::Cas9::U6sgUPRT中的sgRNA替换成NTP1，即构建质粒pSAG1::Cas9::U6sgNPT1；从质粒pUPRT-DHFR-D扩增获得DHFR抗性片段；
(2)弓形虫RH:ΔNPT1虫株的构建
培养速殖子用于弓形虫的电转染，将所述质粒pSAG1::Cas9::U6sgNPT1与DHFR抗性片段电转到弓形虫中，获得弓形虫单克隆虫株，放大培养后，提取基因组DNA，验证NPT1基因是否敲掉，PCR扩不出来者为阳性RH:ΔNPT1虫株；
(3)减毒活疫苗的制备
含FBS的DMEM培养基中加入100μLRH:ΔNPT1虫株，培养并收集RH:ΔNPT1速殖子，过滤细胞碎片，然后用无菌PBS调整速殖子的浓度。
3.如权利要求2所述的用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述DHFR抗性片段扩增的引物为：
DHFR-F：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA；
DHFR-R：GGAATTCATCCTGCAAGTGC。
4.如权利要求2所述的用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，验证NPT1基因是否敲掉时，所用引物为：
KO-NPT1-F：GGATATCTGCTTGATACTGTTGGG；
KO-NPT1-R：TGTTCATCATCAGGAGCTGTTC。
5.如权利要求2所述的用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述速殖子的浓度为106个/200μL。
6.如权利要求1所述的用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗应用于急性弓形虫感染的免疫保护。
7.如权利要求1所述的用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗应用于慢性弓形虫感染的免疫保护。
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