[发明专利]流感病毒的拯救方法及其组合物

说明书

本发明涉及一种新型流感病毒拯救方法以及其组合物。所述方法包括提供稳定整合并表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的宿主细胞，将PA、PB1、PB2和NP基因中分别引入了终止密码子的流感病毒拯救系统导入所述宿主细胞，实现病毒拯救。产生的病毒颗粒可以被用作流感减毒活疫苗，其特点是，由于编码相关蛋白的基因被突变，在人及正常动物细胞中不具有复制增殖能力，仅在上述构建的宿主细胞中可以实现复制增殖，在保证安全性的同时，实现全面激发机体免疫，有效防护机体安全。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制可控型流感病毒的拯救方法及该方法中使用的组合物。

背景技术

流行性感冒(流感)是由流感病毒(Influenza virus)导致的呼吸道和其他脏器的疾病，在健康儿童和成人中，每年均会在春冬季，甚至其它季节有不同程度的流行，通常是一种急性、传染性的疾病。

流感病毒是导致流感的病原体，属于负链单股RNA病毒，其基因组共有8个独立的RNA片段(分别以片段1-8命名)组成，核酸总长度约为13.6kb。这8个片段共编码10种蛋白质，其中8种为结构蛋白，包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2,而NS1、NS2为非结构蛋白。流感病毒分为人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。

病毒复制主要依靠病毒核糖核蛋白(vRNPs)。甲型流感病毒的核糖核蛋白由病毒RNA、RNA聚合酶(RdRp)复合体以及核蛋白(NP)组成，是病毒的最小复制单位，病毒蛋白在该结构基础上才能表达。vRNPs结构中的RdRp由3个亚基(PA、PB2、PB1)组成，PB1位于三聚体的核心，其N末端和C末端分别与PA亚基的C末端以及PB2亚基的N末端通过非共价键(如疏水作用、氢键、范德华力等)形成稳定的蛋白质复合物。

尽管治疗流感病毒可以使用各类抗病毒药物，但由于流感病毒快速变异，世界各地每年有流感的散发流行和暴发，正确接种流感疫苗可以有效的减少流感发病率。

目前，流感疫苗按照其种类可分为：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。流感全病毒灭活疫苗具有较高的免疫原性和相对较低的生产成本，但是在接种过程中副反应发生率也较高，同时不得应用于6岁以下儿童，这些都限制了流感全病毒疫苗的应用；裂解疫苗是建立在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，纯化去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白制备而成，裂解型流感疫苗可降低全病毒灭活疫苗的接种副反应，并保持相对较高的免疫原性，可扩大疫苗的使用范围，但在制备过程中须添加和去除裂解剂，而且在裂解过程中导致大量抗原丢失，导致流感疫苗保护效率降低；在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗；亚单位型流感疫苗具有很纯的抗原组分，但流感疫苗变异很快，因此预防效果上受到了一定的影响。

此外，全病毒灭活疫苗、裂解疫苗，因流感快速变异，需要每年在爆发季节前，对当年可能爆发的毒株进行预测，准确预测有一定难度，预测错误，将导致疫苗保护率大幅度下降，而且，即便准确预测，也因为目前主要采用的鸡胚生产工艺，病毒产生的鸡胚适应性变异，导致疫苗保护效率不高；对于亚单位疫苗，由于目前并没有发现流感病毒可以用于疫苗的保守序列，导致进展缓慢。

在生产方法方面，传统的制备流感病毒疫苗的方法是使用鸡胚制备。然而，利用鸡胚制备的流感疫苗尚存在生产技术以及安全上的问题。例如，培养周期过长，病毒在培养过程中产生的变异性，劳动强度大，效率低，生产成本高，不易于控制产量，并且鸡胚不同批次间的差异大，不利于扩大生产，以用于应对大规模的流感爆发；另一方面，鸡胚自身被细菌或其他病毒污染而致生产的疫苗存在质量及安全隐患，并且生产疫苗后的废胚数量多，无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。

因此，迫切需要更具有安全性并更好的保留全病毒免疫活性的流感疫苗及其生产方法的问世。

发明内容