[发明专利]基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法

说明书

本发明提供一种基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法；首先设计携带非天然氨基酸的把手H‑tag，其次构建含有H‑tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，再次表达纯化在H‑tag中含有非天然氨基酸的融合重组蛋白，最后对融合蛋白H‑tag中非天然氨基酸和核酸底物上的耦合基团进行高效点击化学连接。本方法使用α螺旋把手为非天然氨基酸提供可控的蛋白表面反应条件，避免待测蛋白表面复杂的结构、电荷和极性纳米环境，从而实现对蛋白与核酸进行高效点击化学连接等目标。

技术领域

本发明属于药物化学生物学领域，尤其是涉及一种基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法。

背景技术

目前生物耦合是研究生物大分子相互作用的重要工具，对于深刻理解大分子在细胞生命活动中的功能和药物在调节大分子生物活性的动态机制中具有重大意义，已经成为药物、化学和生物学交叉领域的前沿方向。生物耦合可以发生在蛋白与蛋白、蛋白与核酸、核酸与核酸、以及药物与蛋白核酸之间。常用的生物耦合反应有点击化学、二硫键和马来酰亚胺反应等。参与蛋白耦合的天然氨基酸的基团有氨基、羧基和巯基等。天然氨基酸的修饰基团位点多，总体反应活性高，易于进行生物耦合；但是缺点是位点选择特异性低，无法进行定点修饰。生物正交技术允许细胞使用翻译机器在蛋白中定点引入非天然氨基酸。这突破了天然氨基酸生物耦合基团的选择局限性，极大的丰富了修饰基团库。虽然蛋白的任一位置可通过定点遗传突变引入非天然氨基酸，但是蛋白表面的纳米环境复杂，导致难以预测非天然氨基酸耦合基团的反应活性。影响非天然氨基酸耦合基团反应活性的主要因素包括引入位点的溶剂暴露程度、氨基酸自身和周围电荷水平、以及临近氨基酸基团的极性特征等。通过非天然氨基酸进行蛋白耦合，需要经历复杂的突变位点优化选择程序，并且面临蛋白耦合效率低下的困境。此外，蛋白与核酸的生物耦合对于研究蛋白与核酸的相互作用至关重要。因此，开发一种携带非天然氨基酸引入位点的通用把手，用于对蛋白和核酸进行高效生物耦合，是非常必要的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，用于优化设计蛋白耦合基团位置，特别是基于耦合反应的生物大分子相互作用探测。

本发明采用的技术方案是：基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，使用连接多肽将α螺旋把手与蛋白的末端进行连接，利用扩展遗传编码将非天然氨基酸插入α螺旋把手的特定位点，通过点击化学，实现了蛋白与核酸的高效生物耦合。

具体步骤为：

步骤一基于蛋白二级结构α螺旋，设计携带非天然氨基酸的把手H-tag，通过多肽与待测蛋白的一个末端连接；

步骤二通过定点遗传将把手H-tag的一个密码子突变成非天然氨基酸密码子，通过原核表达载体构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，转入感受态细胞后筛选获得稳定遗传的克隆菌株；

步骤三将含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒和能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒共转化获得原核表达菌株，在培养基中添加非天然氨基酸，使用诱导剂诱导表达融合了H-tag的待测蛋白；

步骤四裂解诱导表达后的原核表达菌株细胞，借助重组蛋白的亲和标签，纯化获得H-tag-待测蛋白的可溶蛋白；

步骤五通过点击化学对H-tag-待测蛋白和核酸底物上的耦合基团进行高效连接，使用凝胶电泳检测反应效率。

优选地，非天然氨基酸为非天然氨基酸耦合叠氮基团，具体为叠氮苯丙氨酸。

优选地，点击化学为张力驱动的叠氮-炔基环化反应。

优选地，步骤一中H-tag长度大于5个氨基酸，设计在待测蛋白的氨基端或羧基端；

优选地，连接多肽长度大于8个氨基酸；