[发明专利]单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒

权利要求书

1.单管检测一种或多种待测目标核酸序列的非诊断的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光，使得不同待测目标核酸序列能够在不同荧光信号通道中区分；所述荧光探针RNHP包含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；所述荧光探针RNHP长度为16-45bp，所述荧光探针RNHP上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp；所述RNA碱基的左侧所述探针片段中G+C含量为40％-60％；和所述RNA碱基的右侧所述探针片段的长度为2-4bp；

步骤2：在核糖核酸酶RNaseH存在下，在核酸聚合酶的作用下等温扩增每种待测目标核酸序列，每种荧光探针RNHP结合到相应的待测目标核酸序列上，形成探针-目标核酸杂交双链；所述核糖核酸酶RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且荧光基团发出荧光；和

步骤3：通过待测目标核酸序列形成的带不同荧光标记的杂交链产物，实现待测目标核酸序列的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少1个RNA碱基为至少1个连续的RNA碱基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述至少1个RNA碱基为1个RNA碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测目标核酸序列为DNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶，或所述待测目标核酸序列为RNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶与AMV逆转录酶；和所述核糖核酸酶RNaseH是耐热核糖核酸酶RNaseH。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述耐热核糖核酸酶RNaseH为RNaseH2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等温扩增为环介导等温扩增、重组酶聚合酶等温扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增、交叉引物扩增技术、核酸依赖性扩增检测技术或切刻内切酶核酸等温扩增。

7.单管检测一种或多种待测目标核酸序列的试剂盒，其特在于，所述试剂盒包括：核糖核酸酶RNaseH，核酸聚合酶，和针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光，使得不同待测目标核酸序列能够在不同荧光信号通道中区分；所述荧光探针RNHP包含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；所述荧光探针RNHP长度为16-45bp，所述荧光探针RNHP上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp；所述RNA碱基的左侧所述探针片段中G+C含量为40％-60％；和所述RNA碱基的右侧所述探针片段的长度为2-4bp；

在核糖核酸酶RNaseH存在下，在核酸聚合酶的作用下等温扩增每种待测目标核酸序列，每种荧光探针RNHP结合到相应的待测目标核酸序列上，形成探针-目标核酸杂交双链；所述核糖核酸酶RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且荧光基团发出荧光；和通过待测目标核酸序列形成的带不同荧光标记的杂交链产物，实现待测目标核酸序列的检测。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述至少1个RNA碱基为至少1个连续的RNA碱基。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述至少1个RNA碱基为1个RNA碱基。