[发明专利]一种检测肺炎链球菌的RCA方法

说明书

本发明公开了一种检测肺炎链球菌的RCA方法，按照如下步骤完成：（1）标本DNA的提取；（2）捕获探针的杂交，（3）锁式探针的环化连接与酶切，（4）RCA扩增，再用琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测肺炎链球菌的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在细菌检测方面具有独特优势。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测肺炎链球菌的RCA方法。

背景技术

肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌。有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。

在化脓性球菌中，肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。不同的是，到目前为止，肺炎链球菌极少对青霉素类抗生素产生耐药性。肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。此菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病。主要引起大叶性肺炎，成人中75％由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起，半数以上为1,2,3型.3型产生大量荚膜物质，毒力强，病死率高.儿童以第6,14,19及23型肺炎链球菌感染最常见.可继发胸膜炎，脓胸，中耳炎，脑膜炎和败血症等。肺炎链球菌在正常人的口腔及鼻咽部经常存在，一般不致病，只形成带菌状态.只有在免疫力下降时才致病.尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿，年老体弱者易发生肺部感染。感染后，可建立较牢固的型特异性免疫.其免疫机制主要是产生荚膜多糖型特异抗体，起调理作用，增强吞噬功能。肺炎链球菌也可侵入机体其它部位，引起继发性胸膜炎、中耳炎、乳突炎、心内膜炎及化脓性脑膜炎等。

针对肺炎链球菌的检查方法有很多，包括涂片染色镜检、荚膜染色、分离培养、小鼠毒力试验和PCR法等，但是目前针对肺炎链球菌的检测方法主要还是涂片染色和PCR检测，涂片染色方法的特异性和灵敏性不高，常常造成假阳性结果；PCR方法灵敏度高、特异性强，但反应条件要求高，并且也存在一定的假阳性反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测肺炎链球菌的RCA方法，该检测方法操作简单、检测时间周期短、高特异性和灵敏性，通过滚环复制法，能够检测出肺炎链球菌。

本发明的技术方案如下：一种检测肺炎链球菌的RCA方法，按照如下步骤完成：

(1)将待测标本按Qiagen公司的细菌DNA提取试剂盒步骤处理，获得含肺炎链球菌的基因组DNA样品；

(2)捕获探针的杂交：在反应管中依次加入含肺炎链球菌的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针，充分混匀，55±1℃水浴杂交0.5-1.5h，缓慢冷却至室温，加入溶于2×结合缓冲液中的链霉亲和素包被的磁珠(2×:2倍工作浓度的结合缓冲液，链霉亲和素包被的磁珠购自上海生物工程有限公司，下同)，混匀，室温放置20-25min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次(1×:1倍工作浓度的结合缓冲液，下同)，弃去洗液。(杂交意义：将待检测的病毒靶基因从病毒基因组中分离出来，提高检测效率和准确度)