[发明专利]编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab‑MR、其表达载体及其应用，旨在解决抗虫基因在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。本发明设计了一种抗虫基因Cry1Ab‑MR及其克隆引物；进一步设计了一种用于遗传转化的含有抗虫基因Cry1Ab‑MR的原核和真核表达载体；同时构建了出了用于遗传转化的原核和真核表达工程菌。并将抗虫基因、真核表达载体、工程菌在转基因植物中的应用。本发明首次提供的抗虫基因Cry1Ab‑MR能够在玉米种表达，并能够显著提供玉米叶片的抗虫性，且可避免基因沉默现象的发生，其在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码Bt杀虫蛋白的基因 Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis，Bt）属于原核生物细菌纲芽孢杆菌科芽孢杆菌属，是一种革兰氏阳性菌。1901年从染病的家蚕体液中被分离出来，发现其对部分鳞翅目昆虫具有毒杀作用。其杀虫原理是：在形成芽孢的过程中，产生了一系列对昆虫具有高度特异性毒杀作用的杀虫蛋白晶体，由于杀虫蛋白晶体自身没有生物活性，被称为原毒素，敏感性昆虫摄取原毒素后，在中肠碱性条件下，原毒素被水解为多肽，这些多肽具有特异的杀虫活性，可与中肠肠道上皮的柱状细胞的特异性受体结合，不可逆地插入质膜中，使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡。因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。

随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始从Bt菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，转基因生物得到迅猛发展。自1987年来，Bt的抗虫基因现已成功转化多种植物中，获得了抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，甚至有的已经开始大面积种植。

但是，早先获得的转基因植物的抗虫性很低，毒蛋白的含量也很低，不能满足生产上的实际需求，大多难以应用；随着抗虫基因的大范围应用，昆虫对杀虫蛋白产生抗性；抗虫基因的抗虫谱窄；外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。上述转Bt毒蛋白基因的抗虫植物在应用中的潜在问题日益显露，影响其持续利用。

随着植物抗虫基因工程的不断深入，目前在基因修饰与改造、表达载体的构建、植物组织的转化方式、抗虫植物的培育等方面成为重点研究方向，以期能够培育抗虫作物，减少环境污染，保护人类健康。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种种编码Bt杀虫蛋白的基因 Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用，以解决抗虫基因易在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于长期大量试验和实践经验，设计一种抗虫基因 Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

综合考虑抗虫基因 Cry1Ab-MR的各种特性及引物的灵敏度，设计了其克隆引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

结合实用特性设计出了一种包含上述抗虫基因的原核表达载体。

构建一种用于遗传转化的原核表达工程菌，该工程菌包含所述抗虫基因序列。