[发明专利]检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法

说明书

本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的检测还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，还涉及用于检测GSH和/或GSSG的试剂盒。本发明的检测方法和试剂盒操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的检测还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，还涉及用于检测GSH和/或GSSG的试剂盒。

背景技术

谷胱甘肽分为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其中GSH的化学名称为N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸，是细胞内含量最高的非蛋白巯基化合物，具有抗氧化、调节免疫应答、抵御外源性毒物等重要生理功能。GSH和GSSG组成了细胞内最重要的氧化还原系统之一，它们的比值GSH/GSSG是氧化应激的重要指标，该比值通常保持在一个相对稳定的范围内，但在异常生理条件下可能会发生改变。除了作为抗氧化剂，在细胞受到外源性毒物沾染时，GSH还可以通过直接或酶促的方式与亲电试剂如卤代烷烃、环氧化合物、重金属离子等发生加合反应保护细胞，降低损伤。因此，细胞内GSH和GSSG的含量检测可作为筛查GSH耗竭事件的重要指标。

目前已有许多针对细胞中GSH和GSSG含量检测试剂盒，多为基于酶循环方法和紫外-可见光吸收光谱(Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-Vis)的分析检测，通常能达到μM或nM的高灵敏度，但是其操作步骤较为繁琐和耗时、成本较高。因此目前仍然需要开发快速、简单、灵敏且能够同时检测细胞GSH和GSSG的产品，以实现对GSH耗竭事件的快速筛查确证。

表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，简称SERS)技术是一种指纹光谱技术，具有分辨率高、实时分析、无损检测、无需复杂的样品预处理、适合痕量分析等独特的优势。目前，已有针对细胞中谷胱甘肽的SERS检测方法，包括直接法和间接法两种，其中直接检测法受GSH和GSSG分子极化率低的影响，灵敏度很低；间接检测法的操作复杂耗时，难以广泛应用。

发明内容

本发明利用DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))与GSH迅速发生氧化还原反应生成TNB，将TNB作为高活性SERS探针，以原位还原法制备的固态纳米银基底作为SERS固态增强基底，成功区分DTNB和TNB信号，从而实现了GSH的间接检测；对于GSSG，本发明首先用N-乙基马来酰亚胺(NEM)将GSH中的巯基掩蔽，然后用还原剂NaBH₄将GSSG还原为GSH，然后再对GSH进行检测。本发明所建立的检测方法操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。

本发明的第一方面涉及一种试剂盒，包括：

SERS固态增强基底，和

5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。

在某些实施方案中，本发明第一方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。

本发明的第二方面涉及本发明第一方面所述的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的用途。

本发明的第三方面涉及一种试剂盒，包括：

SERS固态增强基底，

5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，

N-乙基马来酰亚胺(NEM)，