[发明专利]一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法

说明书

本发明公开了一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法，主要包括提供了一种纤维素酶基因以及提供了一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。主要方法包括：对瘤胃纤维素酶基因的核酸序列进行了测序、构建独龙牛瘤胃微生物宏转录组基因文库、分析独龙牛瘤胃微生物宏转录组数据、研究纤维素酶基因的全基因合成、克隆与酶学性质。本发明最终挑选出来自GH48家族的两个纤维素酶基因并成功克隆，酶学性质研究显示，与市场所购的两种纤维素酶相比，本发明的两种酶在高温与高pH值条件下仍然保持较高的酶活性，具有一定的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及到一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。

背景技术

粗纤维中的纤维素和半纤维素是自然界中含量最多的可再生资源，如今能源短缺已经成为全球性的问题，从可再生生物质资源生产生物燃料是可持续发展的必然趋势，粗纤维的开发和利用被认为是缓解能源问题最有效的途径之一。纤维素酶基因的克隆与表达目前已取得了很大的进展，但没在真正意义上得到高效分解纤维素的工程菌。

反刍动物瘤胃是公认的降解纤维素能力最强的天然发酵罐，是一个良好的大型纤维素酶库，具有很高的研究价值。瘤胃微生物组成及协同作用对纤维素的水解至关重要，但自然环境中绝大多数微生物在实验室无法分离培养，这种瓶颈限制人们对其的研究和利用。宏组学 (包括宏基因组学，宏转录组学，宏蛋白组学，宏代谢组学等)研究避开了微生物分离培养的过程，极大地扩展了微生物资源的利用空间，可以更加全面的了解环境中的微生物，也可以从中筛选与挖掘新的功能基因，是现代基因工程一个新的发展方向和研究热点。

随着高通量测序技术的发展与测序成本的降低，对环境微生物 DNA、RNA进行高通量测序后进行功能分析筛选的可行性大大提高，可以从中筛选出大量的纤维素酶，相比宏基因组学，宏转录组更能反映在特定时空环境下的微生物群落基因的动态表达与调控等问题。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-active enzymes，CAZyme)对地球上所有碳水化合物的合成、降解与修饰起重要作用，因此深入研究CAZyme，对于了解微生物碳水化合物的代谢机制非常重要。碳水化合物活性酶数据库(CAZy，http://www.cazy.org/)是关于能够合成或者分解复杂碳水化合物和糖复合物的酶类的专业数据库，根据蛋白质结构域中氨基酸序列的相似性，可以将不同物种来源的碳水化合物活性酶分成糖苷水解酶(GlycosideHydrolases，GHs)，糖基转移酶 (GlycosylTransferases，GTs)，多糖裂合酶(Polysaccharide Lyases， PLs)，碳水化合物酯酶(Carbohydrate Esterases，CEs)，碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Modules，CBMs)，辅助氧化还原酶 (AuxiliaryActivities，AAs)六大类蛋白质家族，能为纤维素酶基因的研究提供数据支持。目前尚未见到从宏转录组测序数据中挑选纤维素酶基因进行克隆的报道。

综上所述目前在瘤胃纤维素酶的研究上存在以下问题：

传统的培养分离方式不能系统的研究瘤胃微生物的结构与功能，只能分离出少数的纤维降解菌，对大量的不能分离培养的微生物不能进行进一步的研究，难以满足对瘤胃微生物研究的需求。

目前对瘤胃纤维素酶的筛选基本都是把DNA打散构建克隆文库，随机对文库进行功能筛选，虽然目前以找到了很多纤维素酶，但还没有真正意义上的高效纤维素水解酶。而且工作量大，并不能很好的挖掘新的纤维素酶基因。

根据目前的技术发展情况，本发明采用瘤胃宏转录组全测序的方法进行研究，能更加全面的对瘤胃微生物结构与功能进行探索。解决对独龙牛瘤胃微生物结构与功能研究的空白。

目前，缺乏一种专一高效的从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。

发明内容