[发明专利]一种青年猪胰岛细胞培养基及其使用方法

说明书

本发明公开了一种青年猪胰岛细胞培养基及其使用方法。该培养基是在基础培养基(M199)中添加：谷胱甘肽1‑50mM，谷氨酰胺1‑50mM，ITS 0.01‑1％，尼克酰胺1‑50mM，水溶性维生素E 0.1‑20μM，肝素1‑100U/L，4‑(2‑氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.01‑0.5mM，艾塞那肽0.01‑0.1μM。相比与普通培养基(1640、F10、EGM2)能够显著提高青年猪胰岛细胞活率及其成熟率。

技术领域

本发明属于动物胰岛细胞培养技术领域，具体涉及一种青年猪胰岛细胞培养基及其使用方法。

背景技术

I型糖尿病是全世界公认最具威胁的慢性代谢疾病之一，其特点为选择性免疫介导破坏胰岛β细胞，使患者终身需要外源性胰岛素治疗。该疾病晚期爆发各种并发症，将导致患者生活及经济负担的极具加重和高死亡率。自从埃德蒙顿方案成功实施后，胰岛移植受到举世瞩目。在总结全球的胰岛移植研究成果基础后，促进移植方法和免疫抑制方案的改进，为I型糖尿病患者带来了希望。人类胰腺胰岛同种异体移植已经被证实是一种可行的治疗I型糖尿病的方法。移植之后可以改善和控制患者血糖，减少对胰岛素的需求，并降低低血糖症发生几率。但人胰岛来源之困难，胰岛分离纯化技术之不完善，存在疾病传播之风险，使得人胰岛移植有很大的局限性。

猪胰岛素和人胰岛素十分相似，并且血糖调定点相近，作为人体胰岛替代品十分适合。青年猪胰岛相较成体猪免疫源性低，β细胞有一定的分裂潜能；青年猪胰腺虽然未完全的发育成熟，但是和新生猪比较，青年猪的胰腺体积与重量等都更大，胰岛的α-Gal抗原表达比较弱，胰岛的成熟度也相对较高，因此可以获得大量成熟的胰岛细胞。从生理生化特性上来说更适合作为人胰岛的替代品。

现今猪胰岛细胞培养均采用CMRL1066，RPMI等细胞培养基，培养3-5天，维持胰岛的生长或诱导其定向分化。但这些使用方法以及培养基总是存在着很多缺陷，如：培养后胰岛细胞数量不稳定，纯化后获得的有活性功能的胰岛细胞量各不相同(2000IEQ/g-4000IEQ/g)，培养的胰岛细胞纯度也存在差别(70-90％)；培养过程中胰岛细胞因快速凋亡而细胞大量丢失，尤其是β细胞。培养过程的长短也是难以选择，培养时间短β细胞不能发育成熟，培养时间长又会有大量胰岛细胞因凋亡而数量减少，并且由于β细胞的凋亡使同等数量下的胰岛细胞中胰岛素分泌量的减少(insulin/DNA值为<49.00mIU/g)。此外，随着培养时间的延长，胰岛细胞团更易破碎，从而形成更小的胰岛细胞团(直径<50um)更易于凋亡，难以继续培养。时至今日也没有能够提供高纯度的有活性的并且稳定产量的青年猪胰岛细胞培养方法以及培养基，所以如何建立最优化的培养基成分以及培养方式成为青年猪胰岛细胞培养最迫切的问题。

发明内容

本发明的目的是为临床异种移植提供一种高效且稳定的青年猪胰岛细胞团培养体系。

青年猪胰腺相比新生猪胰腺更加成熟，具有较成熟外分泌腺，从而导致分离培养过程中分泌丰富的消化酶，造成胰岛细胞损伤；因此在培养的过程中需添加酶类抑制剂，防止胰岛细胞团被消化酶等破坏。虽然，青年猪胰岛细胞团与新生猪胰岛细胞团相比，其得率及功能更具有优势，但由于青年猪胰岛团本身较成熟、体积相对较大，因此缺氧耐受能力要比新生猪胰岛细胞团差，故在后期培养中考虑额外添加抗氧化剂，以清除由于缺氧产生的过氧、超氧化物对细胞造成的损伤，以提高耐缺氧能力，减少因缺氧而引起的细胞损伤。

持续培养发现F10(含有尼克酰胺、谷氨酰胺等)、EGM-2(含有丙酮酸钠、尼克酰胺等)和RPMI1640培养基分别培养青年猪胰岛细胞，其效果均未达到预期。培养3天胰岛细胞团无法成膜，且单细胞多，无法培养至第5天使其β细胞成熟(见图1)。

本发明的培养基是基础培养基M199中含有谷胱甘肽1-50mM，谷氨酰胺1-50mM，胰岛素转铁蛋白(ITS)0.01-1％，尼克酰胺1-50mM，水溶性维生素E 0.1-20μM，肝素50-100U/L，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.01-0.5mM，艾塞那肽0.01-0.1μM。