[发明专利]双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针及其制备方法

说明书

本发明公开了一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针RPIC，其化学结构式如式（I）所示；同时本发明还提供了该荧光探针的制备方法以及其应用；最后公开了所述荧光探针在在固定细胞与加H₂O₂的细胞的生物学上的应用。本发明的荧光探针通过双激发双发射通道的不同来识别活细胞与死细胞，能够避免假阳性结果和误导信号，预示该探针能够在生理学与病理学的研究进展中作为一个重要工具。

技术领域

本发明涉及一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针及其制备方法，尤其涉及一种在双激发双发射通道的罗丹明类化合物荧光探针及其制备方法与应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

细胞凋亡是胚胎发育过程中发生的一种正常的生理过程，参与组织稳态的维持。细胞凋亡缺陷是导致自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症等多种病理过程的主要原因。选择性诱导细胞凋亡是一种有效的肿瘤治疗策略。凋亡的检测和监测不仅在许多细胞生物学和临床研究中具有重要意义，而且在凋亡靶向治疗的治疗评估中也具有重要意义。因此，在医学和病理学研究中，有必要使用一种有效的方法来可视化细胞凋亡和区分活细胞和死细胞。

目前，用于鉴别活细胞与死细胞的试剂大致可以分为两类。第一种是比色试剂：MTT是一种常用的细胞毒性试剂扩散的测试；第二种是荧光探针：与比色剂相比，荧光剂的荧光性能较好，探针具有较高的灵敏度和灵敏度，具有细胞和组织的原位成像能力是一种较好的检测工具。尽管有许多能够鉴别活细胞与死细胞的探针被合成研究出来，但大多数的探针都为单光子的探针。但是这些探针会检测到一定的误导信号，同时不可避免的出现染色不均一的现象。

发明内容

为了避免可能的误导结果和提供更准确的信息，本发明提供了一种在双激发双发射通道识别活细胞与死细胞的罗丹明类化合物荧光探针，可以同时检测两个通道的荧光，减少了假阳性信号和不均匀染色的影响。本发明要解决的问题是提供一种及其生物学性质。

一种双通道识别活细胞与死细胞的荧光探针，命名为RPIC，其化学结构式如式（I）所示：

所述荧光探针是以绿色与深红色双通道的变化来识别活细胞与死细胞。

上述识别活细胞与死细胞的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）将环己酮与4-二乙氨基酮酸以浓硫酸做溶剂，加热回流，用高氯酸析出沉淀，过滤得到化合物1；

（2）将化合物1与对苯二甲醛以冰醋酸做溶剂，加热回流，反应结束后，将产物通过柱层析法进行分离提纯，得化合物2；

（3）将化合物2与菲醌以冰醋酸做溶剂，加热回流，反应结束后，将产物通过柱层析法进行分离提纯，得化合物RPIC。

上述识别活细胞与死细胞的荧光探针在识别活细胞与死细胞上的应用。

相关实验证实：在癌细胞与吞噬细胞中，本发明所述的荧光探针RPIC可以通过区分深红色和绿色两种颜色的通道来区分活细胞和死细胞。在紫外吸收光谱中发现有多个吸收波长处，证明该探针能够用双激发（图3）。取390nm为激发波长，得到荧光发射光谱（图4）。在细胞的固定实验中试验中，可以看见活细胞在深红通道有强的荧光，固定的死细胞在绿色通道有强的荧光，而在深红通道没有光（图5）；在加入过氧化氢的过程中，没有加入过氧化氢的正常细胞，在深红通道有强的荧光，在绿色通道没有光。加入过氧化氢后，状态变的不健康细胞，在绿色通道有强的荧光，而在深红通道没有光（图6）。推断，该探针能够以绿色与深红色双通道的变化来识别活死细胞。

本发明有益效果

1、双激发双发射通道识别

本发明提供的荧光探针能够以绿色与深红色双通道的变化来识别活死细胞。

2、避免假阳性结果和误导信号