[发明专利]一种香橼叶肉原生质体的分离方法

权利要求书

1.一种香橼叶肉原生质体的分离方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）实生苗获得：选择充分成熟、无病虫害的果实，取出种子，用50℃热水浸种30min，再用冷水浸泡12h，然后用300倍的40wt%福尔马林浸种1～2h，捞出，晾干至种子手摸不发黏，立即播种；

（2）叶片处理：取刚展开的实生苗幼嫩叶片，用蒸馏水洗净，晾干，暗处理1天；去除主脉，切成宽1mm的细条；

（3）预质壁分离：将切好的细条置于5wt%甘露醇溶液中浸泡1h；

（4）酶解：将于甘露醇溶液中浸泡后的细条置于酶解液中，在25℃、黑暗条件下于40 r/min的摇床上酶解2～3h；

（5）纯化：酶解后将溶液用孔径425μm的滤网过滤，滤液以500 r/min离心10min，去除上清液，用13%CPW洗液将沉淀的原生质体小球悬浮，离心5min，用吸管收集下层原生质体；

步骤（4）所述酶解液的配方成分为：5wt%甘露醇+1.5wt% 离析酶R-10+1.5 wt% 纤维素酶R-10。

2.根据权利要求1所述的香橼叶肉原生质体的分离方法，其特征在于：步骤（1）中播种的种子数量为所需种苗数量的1.5～2倍；播种时采用腐熟的有机肥作基肥，与土质疏松的沙壤土一起搅拌均匀，使得土壤最终的pH为5.5～6.0；整畦开沟，均匀播种，然后先覆盖一层1cm的薄土，喷水至土壤手捏成团、不沾手的程度，再覆盖一层稻草保湿，播种深度为2cm。