[发明专利]一种提高乙醇产率的酿酒酵母定点饱和突变基因spt15-N及其应用

说明书

本发明提出了一种提高乙醇产率的酿酒酵母spt15定点饱和基因突变方法。它是利用基因工程手段得到酿酒酵母的spt15定点饱和突变基因，并连接到表达载体pYES2NTc上,构建突变库，共得到了12个单点突变基因，与野生型基因spt15，spt3及对照基因Neo基因构建重组质粒，分别用醋酸锂法转入酿酒酵母INVSC1中，得到15个重组的酿酒酵母菌株。以葡萄糖为底物，将重组酿酒酵母接种发酵，测定其乙醇产率，其中重组酿酒酵母菌INVSC1‑SPT15‑M，INVSC1‑SPT15‑N，乙醇产率大幅度提高，分别为43.0±0.9g/L和43.7±0.2g/L。比对照菌株INVSC1‑Neo分别增加17.8％和19.7％。2个突变基因在127位分别由赖氨酸突变为甲硫氨酸和天冬酰胺。本发明方法简单，操作容易，乙醇产率提高效果明显。具有很好的经济效益和社会效益。

本申请是名称为“一种提高乙醇产率的酿酒酵母spt15定点饱和基因突变方法”、申请号为201610692224.2、申请日为20160819专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及是生物质发酵生产乙醇的技术，特别是一种提高乙醇产率的酿酒酵母spt15定点饱和基因突变方法

背景技术

传统的生物乙醇生产主要以粮食发酵为主,世界粮食紧缺现象严重限制了原料来源。木质纤维素是世界上最为丰富的生物质资源，量最大、价最廉,每年的总产量约占所有生物质资源的50％^[1]，但目前大多数此类的物质没有得到高效利用。以生物质为原料制取的工业乙醇,作为一种清洁的可再生能源,是替代石油等化石燃料的必然趋势,已被纳入许多国家的发展战略规划。

酿酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物,细胞壁厚、固醇含量高,对乙醇及木质纤维素水解物中毒性因子的耐受性较高[3]；能在低pH、严格厌氧条件下快速发酵葡萄糖生产乙醇,副产物少；不易被细菌和病毒污染,且相关工业技术成熟。酿酒酵母全基因组测序已完成[4],是迄今为止研究最透彻的真核微生物,可利用生物信息学的方法和手段,以及日趋完善的分子生物学技术,对其进行基因操作和代谢网络的重构。是乙醇发酵的研究重点和首要目标微生物。酵母菌的乙醇耐受性与多个基因有关，因而通过传统的单基因敲除或过量表达很难达到提高酵母菌乙醇耐性和提高乙醇产率的目的。2006年Alper等报道了通过gTME的方法提高酵母菌乙醇产率和耐性的开创性研究，为酵母菌乙醇产率和耐性代谢工程操作提供了新的思路。

转录水平调控是基因表达调控中效率最高的一个环节。全局转录机制工程(Global transcription machinery engineering,gTME)是一种通过基因转录重排来优化细胞表型的技术^[6]，它通过分子生物学方法，如易错PCR、DNA改组等，建立起始转录因子突变库，改造全局转录调控因子，针对目的产品或目标表型进行定向筛选，使整个转录调控过程发生变化从而改变或提高目标基因的转录及表达，获得目的代谢流增强或特定表型增强的菌种。转录是由RNA聚合酶执行的，在真核生物中RNA聚合酶Ⅱ负责转录产生大部分功能基因的mRNA，而RNA聚合酶Ⅱ转录效率是由起始转录因子和启动子结合能力决定的。酿酒酵母中起始转录因子之一的spt15属于转录起始复合物部分,，是一种TATA结合蛋白^[7]，参与转录起始复合物的形成，控制基因表达效率。它与相关基因启动子区域TATA结合能力的改变，影响相关基因表达效率，从而引起菌种的表型变化。它的突变使相关基因过量表达,在表型上提高了酵母对乙醇耐受能力。

中国专利：一种突变的酿酒酵母起始转录因子及其编码基因与应用(ZL200810024036.8)它利用随机突变技术突变转录因子spt15基因，经过筛选获得spt15的一个突变体spt15-6；另一个中国专利：突变的酿酒酵母起始转录因子基因及其表达载体和应用(ZL201310008539.7)也是利用随机突变技术突变转录因子spt15基因，经过筛选获得spt15的一个突变体spt15-10。它们与原酿酒酵母spt15基因序列的比对有明显的变化。将它们利用基因工程技术构建重组酿酒酵母，发酵检测乙醇产率都有变化，但对工程应用来说，都不理想，即乙醇产率还应进一步提高。