[发明专利]双自杀基因慢病毒表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种双自杀基因慢病毒表达载体及其应用，它包括慢病毒载体及连接在慢病毒载体上的编码RQR8蛋白和HSV‑TK蛋白的核苷酸序列，编码RQR8蛋白和HSV‑TK蛋白的核苷酸序列之间通过编码连接肽的核苷酸连接。本发明构建的双自杀可控开关载体可通过代谢和CDC两种途径诱导细胞凋亡，并且具有筛选功能，在过继免疫治疗时保证了细胞的一致性，临床发生毒副反应时可根据患者的具体病情选择不同治疗手段，为临床治疗提供多种选择。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种双自杀基因慢病毒表达载体及其应用。

背景技术

目前，肿瘤过继免疫疗法(adoptive cell therapy，ACT)已成为继外科手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法，其作用方式是对自体免疫细胞进行体外修饰、激活和扩增，将其重新输回肿瘤患者体内，并辅以适当的生长因子，促使其在体内发挥杀伤肿瘤细胞的作用。ACT包括异体造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem celltransplantation,allo-HSCT)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TILs)、嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)、TCR修饰的T细胞(T cell receptor-gene engineered T cells,TCR-T)等。随着临床实践的增多，ACT的安全性也逐渐受到关注，ACT仍存在着脱靶效应、过敏反应、细胞因子释放综合征等毒副反应。由于细胞药物不同于单抗和小分子药物，回输的T细胞本身具有可增殖的生命活性，如何在体内实现便捷可控的自我清除能力，已成为ACT研究的一大方向。

自杀基因技术是通过基因编辑使T细胞携带自杀基因，通过口服或静脉输注方式给予药物，使体内扩增活化的T细胞在药物作用下进行自我清除的一种策略。自杀基因的作用机制主要分为三种：代谢型、二聚化结构诱导型、单克隆抗体介导型。其共同点为特异性清除过继输注T细胞，而对邻近的其它细胞组织无损伤。单纯疱疹病毒型胸苷激酶(HSV-TK)为代谢型，在胞内表达，与无毒性前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV)结合，可使GCV磷酸化为二磷酸化、三磷酸化产物，变成dGTP的竞争性抑制物，引起碱基错配，终止DNA链3′-OH端碱基的延长，进而导致细胞死亡。RQR8是CD20一个模拟表位和CD34一个模拟表位组成的膜蛋白小分子，其中CD34表位作为筛选鉴定标签，CD20表位可被利妥昔单抗识别，启动补体系统，从而介导补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity；CDC)导致细胞死亡。

肿瘤过继免疫治疗与普通药物治疗不同，过继疗法是对免疫细胞在体外进行基因修饰，以增强免疫细胞对肿瘤的杀伤活性，经活化扩增后回输患者体内进行肿瘤清除的一种治疗方式。细胞药物由于自身具有生命活性，在体内可增殖且长期存活。已有研究显示，过继输入的T细胞在体内的存活时间可长达14年，且增殖速度不可预估，因此始终存在着发生不良反应的风险。Daniel W L等的研究表明，对21患者进行CD19CAR-T治疗后，有7例出现了细胞因子释放综合征，其中有3例意识严重丧失且需要呼吸支持，同时还出现了发热、低血钾症、中性粒细胞减少等症状。为防止过继免疫治疗发生致命性不良反应，可在对T细胞进行基因修饰时预先设置自杀基因开关，在必要时加入外源性药物诱导启动自杀程序，快速消除风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种双自杀可控开关载体，可通过代谢和CDC两种途径诱导细胞凋亡，并且具有筛选功能，在过继免疫治疗时保证了细胞的一致性，临床发生毒副反应时可根据患者的具体病情选择不同治疗手段，为临床治疗提供多种选择。

本发明的技术方案为：双自杀基因慢病毒表达载体，它包括慢病毒载体及连接在慢病毒载体上的编码RQR8蛋白和HSV-TK蛋白的核苷酸序列，编码RQR8蛋白和HSV-TK蛋白的核苷酸序列之间通过编码连接肽的核苷酸连接。