[发明专利]一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法

说明书

本发明公开了一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，本发明的方法包括：第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培养基对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；第2天，使用添加40～60ng/ml bFGF的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第3～5天，使用添加40～60ng/ml VEGF和20～30ng/ml BMP4的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第6天对上一步诱导培养后的细胞进行消化，然后采用内皮细胞培养基继续培养3～4天。本发明分化内皮细胞的方法更加的经济有效，分化过程更加方便快捷；分化过程中不使用血清，排除多种因素的干扰，并且分化结果更可靠；且添加RA可以促进内皮分化的效率，一次分化可以得到更多的内皮细胞。

技术领域

本发明涉及一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

血管疾病影响数百万人的健康。严重的血管疾病导致截肢和危及生命的中风。在所有血管腔内排列的内皮细胞在调节血管通透性，血管生成和组织再生起着至关重要的作用。在生理条件下，血管可以通过血管发生和血管生成产生。血管发生是指从祖细胞形成新血管，而血管生成是指通过现有血管细胞的迁移和增殖从现有血管形成新血管。然而，这些过程在患有中风，糖尿病或老年痴呆症的患者中受到损伤。在血管疾病中，由于内皮细胞的异常病变或者死亡导致血管功能恶化，最近有研究表明，内皮细胞具有形成血管的能力，且对于改善血管疾病有很大的帮助，因此，需要获得大量的人源的内皮细胞来治疗这些血管疾病。

人多能干细胞，例如人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导的多能干细胞(hiPSC)，能够自我更新并分化成人体中的任何细胞类型，因此是产生内皮细胞(ECs)的理想资源。许多研究小组已经证明ECs可以来源于hiPSCs和hESCs。这些诱导得到内皮细胞可用于自体的缺血区域的血管重建和定制人造血管和组织,另外，体外利用多能干细胞分化内皮细胞也为研究调控内皮命运的分子机制提供了新的途径。通过机制研究有助于理解血管疾病的发病机制以及为治疗血管疾病提供有效的措施。然而，在开发临床应用之前，必须建立从多能干细胞中获得ECs的低成本且高效的方法。此外，需要进一步探索调控多能干细胞分化内皮细胞的机制。

目前分化内皮祖细胞的方法有很多种，但普遍存在分化的过程复杂，分化周期长，成本较高，分化不稳定等缺点。首先，在贴壁细胞分化方法中：2015年，GopμSriram等，使用StemDiff APEL，ECGM-MV2等分化培养基，连续添加BMP4、FGF2、VEGF的情况下，获得CD31/CD144双阳性的细胞比例为80.7％。但是此方法所用StemDiff APEL、ECGM-MV2分化培养基价格过高，使分化成本大大增加。2017年，Kit Man Tsang等，在连续七天的缺氧条件下，使用BMP4、FGF2、VEGF，使得内皮的分化效率由常氧下的12.4％提升为29.3％。在悬浮细胞分化的条件下，2010年，Hongkui Deng等，使用EB分化的方式，在七天的过程中，使用BMP4，VEGF的方法，获得27％的CD34阳性的祖细胞。

目前，关于分化内皮细胞存在以下缺陷：成本过高，mTeSR培养基，StemDiff APEL，ECGM-MV2培养基价格过高，不适合大量培养和分化内皮细胞；现有技术分化效率低，得率低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，本发明的方法降低了人胚胎干细胞H1系和人多能诱导干细胞体外诱导内皮细胞的成本，并进一步用视黄酸RA提高内皮细胞的分化效率，在一次分化过程中获得更多的内皮细胞。

本发明的第一个目的是提供一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，包括如下步骤：

(1)在第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培养基，对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；