[发明专利]一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及用途

权利要求书

1.一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)，免疫原的制备，具体是：

扩增或设计合成P序列，构建PGEX-4T-1-P重组表达载体，利用大肠杆菌表达系统表达NoVGⅡ.4型P蛋白，经GST亲和层析柱纯化，制备P颗粒；

2)，动物免疫，具体是：

取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将NoV96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种GⅡ.4型NoV P颗粒等比例混合，再与等体积的弗式完全佐剂混合并乳化，在小鼠颈背部皮下多点免疫，免疫量为60ug/只；间隔14天后，用等量的复合抗原伴有弗氏不完全佐剂进行加强免疫，免疫量为30ug/只，共进行5次加强免疫，以60ug/只的免疫量冲击免疫3天后取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；

3)杂交瘤细胞株的制备和筛选，具体是：

将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过PEG1500融合，制备杂交瘤细胞；

七天之后，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选特异性针对GⅡ.4型诺如病毒的抗体；

4)杂交瘤细胞的克隆化，具体是：

采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆，连续克隆培养多次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养阳性细胞株，冻存。

2.根据权利要求1所述的GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1)中制备的免疫原为GⅡ.4型NoV P颗粒，分别为GⅡ.4型NoV96簇、2004簇、2006b簇和2010簇。

3.根据权利要求2所述的GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，其特征在于，

分别采用NoV96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种GⅡ.4型NoV P序列按照步骤1)的方法制备得到NoV96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种GⅡ.4型P颗粒。

4.根据权利要求3所述的GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1)中免疫原的制备过程具体是：

将P序列进行BamH I和Not I双酶切，再与经BamH I和Not I双酶切的pGEX-4T-1表达载体连接得到连接产物pGEX-4T-1-P，连接产物pGEX-4T-1-P转化至感受态细胞TOP10得到重组质粒，将重组质粒经双酶切鉴定；

将鉴定正确的重组质粒转化到感受态细胞BL21，挑取单个菌落接种于5ml氨苄青霉素含量为100mg/ml的LB液体培养基中，在37℃下、以200r/min震荡培养12-16h，将培养物以1:100的稀释度接种于新鲜LB液体培养基中，于37℃震荡培养3.5h至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入IPTG使得IPTG在LB液体培养基中的终浓度为0.4mmol/L；继续在22℃下，以220r/min震荡培养12-16h；于4℃、5000rmp离心菌液12min，弃上清，收集菌体，用80mlPBS重悬菌体，并将菌液于冰浴中对其进行超声破碎，于4℃，12000rmp离心75min；利用GST-resin结合GST-P蛋白，用PBS洗去杂蛋白，用凝血酶除去融合蛋白GST-P的GST标签蛋白，获得P颗粒。

5.根据权利要求4所述的GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤3)中通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选特异性针对GⅡ.4型诺如病毒的抗体，具体是：

以NoV VA387P颗粒作为包被抗原、HRP-羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞，并以抗VA387P颗粒鼠多抗血清为阳性对照，未免疫鼠血清为阴性对照，通过酶标仪读取OD₄₅₀值；读数时以P/N值>2.1为判断标准，P/N值>2.1判定为阳性，否则为阴性。

6.抗诺如病毒GII.4型鼠源单克隆抗体，其特征在于：通过如权利要求1至5任意一项所述的方法制备而成。