[发明专利]检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用

说明书

本发明公开了一种检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物及其应用。本发明的检测橡胶树褐根病病菌的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。基于该LAMP引物组合物建立的橡胶树褐根病病菌可视化检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。本发明的LAMP引物组合物及其检测方法能在田间实现橡胶树褐根病病菌的快速、灵敏、准确检测和鉴定，为橡胶树褐根病的早期预警及防控提供可靠的技术手段和理论依据。

技术领域

本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)的LAMP引物组合物、试剂盒和应用，可实现橡胶树褐根病的早期诊断、病菌的监测和鉴定。

背景技术

天然橡胶是全球重要的工业原料和战略物资，是国防工业和高端装备生产中不可替代的重要原料，在我国主要分布于云南、海南、广东、广西、福建、台湾等地区。我国天然橡胶的种植面积和产量均居世界第五位，也是全球最大的消费国和进口国。褐根病是橡胶生长中一种毁灭性的土传病害，在世界各植胶区严重以及普遍发生，是限制我国橡胶单产提高的重要生物因子。该病害主要通过根系接触传染，染病植株因根部腐朽生长衰弱、树叶变黄、枯萎脱落，从黄化到枯死通常仅需半月至三个月。对天然橡胶产业造成较大的经济损失。

由有害层孔菌[Phellinus noxius(Corner)Corner G.H.Cunn.]引起的橡胶树褐根病是天然橡胶生产中危害最为严重的根部病害，发生严重的林段发病率达10％以上，且死树率高。褐根病发生早期不易被发现，待其出现病症时，病菌危害已十分严重，防治十分困难。因此，建立快速、准确、灵敏、高效的检测技术，及时检测出树体中的病原菌并采取科学有效的防治措施，对控制橡胶树褐根病的传播蔓延具有重要作用。

目前对橡胶树褐根病菌的检测以病症识别及组织分离病原菌为主，但传统方法往往专业性强、耗时长、灵敏度低，难以达到快速诊断和检测的目的；利用分子生物学技术检测该病病原菌方法有常规PCR方法(梁艳琼等，2016)，虽然能够快速、准确检测出病原，但需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器设备和分子生物学专业的实验人员操作，不适宜在基层以及田间大规模应用，使田间病情无法及时、准确的检测及有效防控。

LAMP是一种在恒温条件下，快速、高效、特异的扩增靶序列的核酸扩增技术(Notomi et al.,2000)，该技术在短时间内可实现大量扩增，60℃～65℃恒温反应30min～60min内便能达到10⁹～10¹⁰倍的扩增，在反应产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断扩增结果，其特异性和灵敏性高，且不需要昂贵仪器设备，仅需在恒温水浴锅内即可完成，具有操作快速简便、特异性强、灵敏度高、检测成本低等特性。目前该技术已在植保等诸多领域得到广泛应用，极大提高了鉴定效率和准确率。迄今，还未见应用LAMP技术对橡胶树褐根病病原菌进行检测的报道，因此建立高效、快速的橡胶树褐根病菌LAMP检测技术可为橡胶树褐根病的发生和防治提供重要的技术手段。

发明内容

本发明的目的是克服传统诊断方法的繁琐、耗时长、准确度低和经验要求高以及PCR检测技术所需昂贵仪器设备、不便在田间直接检测等问题，提供一种橡胶树褐根病病菌LAMP检测引物以及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

本发明另一目的在于提供上述快速检测方法在橡胶树褐根病的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。

本发明的第一方面提供了一种用于橡胶树褐根病病菌LAMP快速检测的引物组合物。

一种用于橡胶树褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP快速检测的引物组合物，由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物核苷酸序列为：