[发明专利]一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法在审
| 申请号： | 201910201825.2 | 申请日： | 2019-03-18 |
| 公开（公告）号： | CN109837260A | 公开（公告）日： | 2019-06-04 |
| 发明（设计）人： | 戴瞻 | 申请（专利权）人： | 南京欧凯生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/18 | 分类号： | C12N9/18;C12N15/85;C12N15/55 |
| 代理公司： | 北京挺立专利事务所(普通合伙) 11265 | 代理人： | 倪钜芳 |
| 地址： | 210000 江苏省南京市江北新区*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因片段 重组表达 蛋白 人胚肾细胞 表达质粒 上皮细胞 人胚肾 合成 免疫诊断试剂盒 翻译后修饰 密码子优化 表达载体 方法提取 功能研究 亲和层析 生物功能 瞬时表达 转染试剂 磷脂酶 构建 介导 转入 优化 应用 开发 | ||
1.一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对Lp-PLA2基因片段进行密码子优化；
（2）构建表达质粒：合成步骤（1）优化后基因片段，连接到表达载体上，获得Lp-PLA2表达质粒；
（3）将步骤（2）中表达质粒通过转染试剂介导，转染入人胚肾上皮细胞HEK293中，进行细胞培养和Lp-PLA2蛋白瞬时表达；
（4）收集步骤（3）中分泌表达Lp-PLA2蛋白细胞培养基，进行分离纯化获得Lp-PLA2蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，步骤（1）中密码子优化采用德泰生物最新开发的密码子优化软件MaxCodonTMOptimization Program (V13)，优化后密码子适用于表达宿主细胞偏爱性。
3.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，步骤（2）中所述构建表达质粒，具体步骤包括：引物设计与合成，PCR获取Lp-PLA2基因片段，重组连接获取表达质粒。
4.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，步骤（2）中表达载体为德泰生物研发的适用于人胚肾上皮细胞特异性的表达载体。
5.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，步骤（3）中将表达质粒转染人胚肾上皮细胞转染方法为化学试剂法，具体步骤包括：种子细胞培养，形成质粒DNA-转染试剂复合物，将所述复合物加入所述种子细胞中。
6.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，步骤（3）所述HEK293细胞培养，采用无血清悬浮培养。
7.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，在步骤（3）细胞培养表达过程中通过补料优化提高Lp-PLA2蛋白的表达量，补料包括L-Glutamine，胰酪蛋白胨，葡萄糖。
8.根据权利要求1所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，步骤（4）中分离纯化条为亲和层析，采用Ni-IDA Beads分离提纯Lp-PLA2蛋白，具体步骤包括：离心收集分泌表达Lp-PLA2蛋白细胞培养基上清，上清进行预处理，Ni-IDABeads亲和纯化，梯度洗脱获取蛋白。
9.根据权利要求7所述的一种利用人胚肾上皮细胞重组表达Lp-PLA2的工艺方法，其特征在于，补料条件为：转染后48h添加4-8mM/L L-Glutamine，5-10mg/L胰酪蛋白胨，3-4mg/L葡萄糖。
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