[发明专利]多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法

权利要求书

1.一种多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌，其特征在于：命名为：SeNPs-rVIP-Lactococcus lactis NZ9000，缩写为：SeNPs-rVIP-L.lactisNZ9000；生物表达为：益生菌L.lactis NZ9000能够将毒性的亚硒酸钠转化为无毒的红色单质纳米硒SeNPs，并将纳米硒富集于菌体内；胞外含有重组分泌表达的抗菌肽VIP，胞内富集纳米硒SeNPs的乳酸乳球菌微生态制剂。

2.根据权利要求1所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌，其特征在于：所述纳米硒富集在L.lactis NZ9000菌体细胞内，且纳米硒的粒径为50nm-180nm。

3.一种权利要求1或2所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于步骤如下：

步骤1、抗菌肽VIP的重组分泌表达载体的构建：

设计VIP基因序列：引入信号肽序列SP_usp45，His标签和限制性内切酶识别位点；所述内切酶为NcoⅠ和KpnⅠ；

构建抗菌肽VIP的重组分泌表达载体：将抗菌肽VIP基因及载体pNZ8148分别进行双酶切，然后将酶切后的质粒pNZ8148和VIP基因进行连接，以将目的基因构建到表达载体上，获得VIP的重组表达质粒rVIP-pNZ8148后转化至MC1061感受态细胞；

构建步骤：使用双酶切连接法构建重组分泌表达载体时，按外源基因与质粒摩尔数比为3:1的比例进行混合，反应体系为10μL，16℃过夜，转化至MC1061感受态细胞：过程为：将制备好的MC1061感受态细胞迅速置于冰水浴中；将10μL连接体系加入到感受态细胞中，冰浴20min；42℃水浴脉冲30s，快速移至冰水浴中放置3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、200±10rpm摇床培养45min；取部分菌液涂布于LB平板；37℃倒置培养12-16h；所述LB平板是上含34μg/ml氯霉素；

所述MC1061感受态细胞的制备：挑取1个单克隆，加入5mL SOB培养基，37℃、200±10rpm培养至指数生长后期；取2mL菌液加入100mL SOB培养基中，于18℃、200rpm培养至OD_600nm＝0.55，置于冰上10min；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全除去水滴，加入1/3体积的预冷工作液，用移液枪悬浮菌液；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全吸去水滴；加入1/12体积工作液，悬浮菌体；逐渐加入DMSO并混匀，冰上放置10min；分装进入1.5ml无菌离心管中，液氮放置1h后进行后续转化；所述DMSO的加入量为：0.3ml/50mL菌液；

步骤2、抗菌肽VIP的富硒诱导表达：

将重组质粒rVIP-pNZ8148电转至L.lactis NZ9000感受态细胞，得到VIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000重组菌，具体电转方法如下：将重组质粒rVIP-pNZ8148与L.lactisNZ9000的感受态细胞混合，冰浴5min；将混合物转入无菌预冷的2mm电转化杯中；于2.0kV、186Ω下电击；之后加入1ml冰预冷的含有3％甘油、5％蔗糖、20mM氯化镁及2mM氯化钙的M17培养基中30℃静置培养2h；取100μL菌液涂布于含有10μg/mL氯霉素的M17琼脂培养基上，30℃培养48h；重组菌接种至20mL的M17培养基于30℃静置培养过夜，加入亚硒酸钠Na2SeO3培养11～13h；取部分培养液按照4％的比例分别接种于50mL新鲜的M17培养基中，于30℃静置培养，当吸光度OD_600nm达到0.4左右时，向培养基中加入诱导剂nisin诱导2.5h；诱导表达结束后，将整个发酵液冷冻干燥，即为该微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000；所述加入亚硒酸钠Na₂SeO₃的终浓度200μg/mL；所述加入诱导剂nisin的终浓度100ng/mL；

步骤3、重组表达抗菌肽VIP分离纯化：

诱导表达后的培养液于4℃、12000±1000rpm离心5min后，收集上清液A，并用20mmol/L的PBS清洗菌体，于4℃、12000±1000rpm离心5min，重复清洗1～2次；然后向菌体中加入溶菌酶，充分混匀后于37℃水浴孵育1h，反应过程颠倒混匀数次，离心后收取上清液B；将上清液A与B充分混合后经His-Trap HP亲和层析进行分离、纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，再经脱盐柱Sephadex G25脱盐后可得到纯化的重组表达抗菌肽VIP；所述PBS的pH7.0；所述溶菌酶终浓度为10mg/mL。