[发明专利]一种斯氏普罗威登斯菌固定化酶的制备方法及应用

权利要求书

1.一种斯氏普罗威登斯菌固定化酶的制备方法，其特征在于：其以斯氏普罗威登斯菌Providencia stuartii为菌种，以海藻酸钠为固定化材料，将经菌悬液扩繁和降解酶剂超声破碎提取制备斯氏普罗威登斯菌酶液有效地包埋而制成固定化酶。

2.根据权利要求1所述的斯氏普罗威登斯菌固定化酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)菌悬液制备：无菌条件下加入无菌磷酸盐缓冲液于培养48h的菌种培养皿中平行振荡，并用接种环轻轻刮落培养基表面的菌落，即成粗制菌悬液，将其转移到液体发酵培养基中在pH为7～8，30～35℃，150～200rpm条件下培养48h；将取出的发酵液立即在8000～10000r/min，3～4℃下离心10～15min，收集湿菌体，并用无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次；然后将无菌磷酸盐缓冲液与湿菌体混匀，控制菌体数量为≥6×10¹⁰cfu/mL；制得的菌悬液3～4℃保存备用；

2)游离酶提取：对步骤1)制得的菌悬液进行超声破碎提取游离酶，超声破碎时间10～15min，功率320W，每10s一个周期；破碎液在8000～10000r/min，3～4℃下离心10～15min，得上清液即制得游离酶；上清液游离酶含量控制在大于等于2.80mg/mL；

3)固定化酶制备：将游离酶液按体积比为1:10与3％海藻酸钠溶液充分混匀后，用注射器将混合液滴加入4％的氯化钙溶液中使用磁力搅拌器不断搅拌，在3～4℃凝胶化10～15h使之成为微球，微球直径大致为2～3mm，即为斯氏普罗威登斯菌固定化酶。

3.根据权利要求1或2所述的斯氏普罗威登斯菌固定化酶的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养基由如下原料制成：牛肉膏8g/L、酵母膏14g/L、NaCl 5g/L。

4.一种如权利要求1或2的方法制备的斯氏普罗威登斯菌固定化酶的应用，其特征在于：所述斯氏普罗威登斯菌固定化酶应用于高效降解土壤、水体中的菌核净。

5.一种如权利要求1或2的方法制备的斯氏普罗威登斯菌固定化酶的应用，其特征在于：所述斯氏普罗威登斯菌固定化酶应用于高效降解土壤和水体中的烯菌酮和异菌脲。