[发明专利]LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用

说明书

本发明公开了一种LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用，涉及治疗血脂异常药物技术领域。制备方法为将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染肝细胞；突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；转染后，更换无血清培养基继续培养，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；再进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。本发明所述外泌体为内源细胞产生的天然载体，以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。

技术领域

本发明涉及治疗血脂异常药物技术领域，具体涉及一种过表达LDLR突变体的细胞外泌体及制备与应用，尤其是过表达人类低密度脂蛋白受体基因突变体(mutant low-density lipoprotein receptor,mLDLR)的细胞外泌体及其制备方法和用于制备治疗血脂异常药物的应用。

背景技术

血脂异常主要包括总胆固醇(Tch)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低。纯合子家族性高胆固醇血症(HomozygousFamilial Hypercholesterolemia,HoFH)是一类引起血脂异常的单基因病，HoFH患者低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)表达降低，血清Tch与LDL-C水平显著升高，并导致动脉粥样硬化和心脑血管疾病。除单基因突变导致的血脂异常外，由于环境和生活方式的变化，2015年《中国居民营养与慢性病调查报告》显示2012年中国成人血脂异常患病率为40.40％，呈现为国民血脂异常的普遍暴露状态。

血脂异常，特别是LDL-C或Tch升高是动脉粥样硬化性心血管疾病(导致全球致残致死的首要病因，包括冠心病、脑卒中和外周动脉疾病等)的重要危险因素。人群血清胆固醇水平升高将导致我国心血管病事件增加约920万(2010年～2030年)；而LDL-C水平每降低1mmol/L，全因病死率可下降19％，冠状动脉事件下降23％，心脏事件下降21％，降低LDL-C水平可稳定、延缓或消退动脉粥样硬化病变，并显著减少这些致死致残性疾病的发生率。因此，降低LDL-C水平是防控动脉粥样硬化性心血管病危险的首要干预靶点，发现并精准调控LDL-C水平的新型药物对维护人类健康具有重大意义。

LDLR基因位于第19号染色体短臂(Chl9p13.1.13.3)，全长45kb，由18个外显子和17个内含子组成，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应：(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子l编码的5’端序列及信号肽；(3)外显子2-6编码LDLR配体结合域；(4)外显子7-14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR氧连接糖链结构域；(6)外显子16和17编码跨膜结构域；(7)外显子17和18编码的胞浆区。

细胞内新合成的LDLR前体由860个氨基酸残基组成，分子量120KDa，在由内质网向尔基体转运中，切去由21个氨基酸残基组成的信号肤，加上18个氧连接和2个氮连接的寡糖链，成熟LDLR分子量160KDa，于合成后约45分钟时到达细胞表面，并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coatediPt)内。

外泌体是由细胞主动向细胞外分泌的双层囊泡小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程。以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好、靶向性强、并能跨越血脑屏障等独特优势。因此，以外泌体为载体，针对病因进行精准靶向治疗具有广阔的应用前景。